冬凌草甲素的聚乙二醇修飾物的合成及其體內(nèi)外性質(zhì)的研究.pdf

1、冬凌草甲素(oridonin，ORI)是由唇形科(Labtea)香茶菜屬(Rabdosia)植物冬凌草中提取出的一種貝殼杉烯二萜類有機(jī)化合物。有研究表明，冬凌草甲素具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖和促凋亡作用，其分子中與環(huán)外亞甲基共軛的環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)是其抗癌活性中心，對(duì)白血病、肝癌、食管癌、結(jié)腸癌、肺癌等均有一定的療效。然而冬凌草甲素難溶于水及一般有機(jī)溶劑，吸收率低，體內(nèi)生物半衰期短，這些缺陷都影響了其臨床療效，目前有關(guān)制劑

2、的臨床抗癌療效并不理想，因此，需要尋求新的方法以增加冬凌草甲素水溶性、改善其生物利用度，從而提高其抗癌療效。
　　前藥的設(shè)計(jì)可有效地解決某些藥物的水溶性和穩(wěn)定性問題，增加藥物在血液循環(huán)中存留的時(shí)間，改變藥物體內(nèi)分布特性，從而提高藥物生物利用度，降低藥物毒副作用。近年來，一些大分子前藥引起了研究者極大的關(guān)注，它可通過延長藥物在體內(nèi)的半衰期來提高藥效，避免降解，增加藥物的穩(wěn)定性;還可提高細(xì)胞通過內(nèi)吞作用對(duì)藥物的攝取，通過配體使藥物對(duì)靶

3、向細(xì)胞有效位點(diǎn)特異性識(shí)別。
　　在各種高分子材料中，聚乙二醇以良好的水溶性、無毒、良好的生物相容性和無免疫原性等其他高分子無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，在前藥的合成與制備中占有非常重要的地位。聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)是一種pH中性、無毒、水溶性較高的親水性聚合物，其重復(fù)單元為氧乙烯基，端基為兩個(gè)羥基，呈線性或支化鏈狀結(jié)構(gòu)。PEG在修飾小分子藥物時(shí)，可以將它的許多優(yōu)良性質(zhì)隨之賦予所形成的復(fù)合物，如提高被修飾藥物的溶

4、解性、延長藥物循環(huán)半衰期和增強(qiáng)療效等，這使得許多療效顯著但由于其疏水性和毒性大等缺陷而限制臨床應(yīng)用的小分子藥物有了新的發(fā)展前景。
　　本課題以冬凌草甲素為模型藥物分子，以甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH2)為水溶性骨架，丁二酸為間隔分子，制備得到了4種不同分子量的冬凌草甲素的聚乙二醇修飾物，并考察了合成路線中反應(yīng)物配比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、催化劑用量與配比、冰浴時(shí)間等對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)率的影響，從而確定了較適合的反應(yīng)條件，用于冬凌草甲素的聚

5、乙二醇修飾物的制備。采用紅外光譜(FTIR)及高效凝膠色譜(SEC-HPLC)對(duì)四種甲氧基聚乙二醇胺修飾的冬凌草甲素(PEG-SA-ORI)前藥進(jìn)行了初步結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果證明小分子藥物冬凌草甲素確實(shí)連接到了高分子的甲氧基聚乙二醇胺骨架上。
　　運(yùn)用紫外分光光度法(UV)測定四種不同分子量的PEG-SA-ORI衍生物中的冬凌草甲素含量，通過對(duì)比四種衍生物發(fā)現(xiàn)，其中ORI含量的大小主要取決于所用甲氧基聚乙二醇胺的分子量，PEG5kDa-

6、SA-ORI衍生物的ORI含量最高，其冬凌草甲素的偶聯(lián)率達(dá)到89.4％，而PEG40kDa-SA-ORI衍生物的ORI含量最低，其偶聯(lián)率為48.9％。
　　使用直接觀察法研究了四種不同分子量的衍生物在水中的溶解性，結(jié)果表明，與水溶性很差的小分子冬凌草甲素相比，所合成的四種聚乙二醇修飾物均使得冬凌草甲素的水溶性有所改善。其中分子量最大的PEG40kDa-SA-ORI衍生物在水中的溶解度為789.4mg·mL-1（相當(dāng)于冬凌草甲素3.

7、51mg·mL-1，提高了4.7倍），分子量最小的PEG5kDa-SA-ORI衍生物在水中的溶解度達(dá)到1250mg·mL-1（相當(dāng)于冬凌草甲素74.75mg·mL-1，提高了99.2倍），說明聚乙二醇修飾技術(shù)具有很好的增溶效果。
　　采用高效液相色譜法(HPLC)研究了四種聚乙二醇化冬凌草甲素原料藥及其在水溶液中的穩(wěn)定性，結(jié)果表明四種衍生物在不同條件下的穩(wěn)定性均較好，其中溫度對(duì)其穩(wěn)定性影響較大，溫度升高，冬凌草甲素的解離明顯加快，

8、說明高溫環(huán)境不利于衍生物的貯存。此外，原料藥的穩(wěn)定性顯著高于其在水溶液中的穩(wěn)定性，說明以干粉形式儲(chǔ)存比配制成水溶液更有利于提高PEG-SA-ORI衍生物的穩(wěn)定性。
　　PEG-SA-ORI衍生物在pH5.5及pH7.4兩種環(huán)境下的體外釋藥特性研究表明PEG-SA-ORI衍生物在pH5.5及pH7.4條件下均表現(xiàn)出一定的雙相釋藥特性，在實(shí)驗(yàn)初始階段，其冬凌草甲素解離釋放得較快，而后ORI的釋放速率逐漸減小，藥物緩緩解離釋放至介質(zhì)中。

9、在相同pH條件下不同分子量的PEG-SA-ORI衍生物的釋放研究顯示其中ORI的釋放速度及程度與甲氧基聚乙二醇胺的分子量大小密切相關(guān)，分子量較大的PEG-SA-ORI分子中ORI解離的較慢。在不同pH環(huán)境下，PEG-SA-ORI衍生物中的ORI釋放有所不同，PEG-SA-ORI在pH5.5的釋放介質(zhì)中更易釋放出ORI，說明PEG-ORI-SA具有一定pH敏感性，弱酸性環(huán)境更有利于其釋放出藥物分子發(fā)揮作用。
　　采用MTT法考察了P

10、EG-SA-ORI衍生物及冬凌草甲素溶液在不同濃度和不同時(shí)間對(duì)人白血病K562細(xì)胞的體外抑制活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PEG-SA-ORI衍生物對(duì)人白血病K562細(xì)胞具有生長抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)明顯的時(shí)間和濃度依賴性。隨著作用時(shí)間延長，PEG-SA-ORI衍生物作用效果增強(qiáng)。Hoechst染色法觀察了PEG-SA-ORI衍生物處理后K562細(xì)胞的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞Hoechst染色后染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞核完整，細(xì)胞呈均勻淡藍(lán)色，而PEG

11、-SA-ORI及ORI溶液處理后的細(xì)胞核呈現(xiàn)明亮藍(lán)色熒光，表現(xiàn)致密濃染，說明ORI及其PEG衍生物促進(jìn)了K562細(xì)胞的凋亡，PEG-SA-ORI能夠有效地釋放出活性成分冬凌草甲素。
　　本文采用高效液相色譜法(HPLC)分別測定了大鼠尾靜脈注射PEG10K-SA-ORI、PEG20K-SA-ORI和ORI溶液后其血液中冬凌草甲素的經(jīng)時(shí)變化規(guī)律。研究結(jié)果表明PEG-SA-ORI衍生物的藥物動(dòng)力學(xué)特征與ORI-Sol差別很大。靜脈注射

12、ORI-Sol后，雖然檢測到初始的冬凌草甲素濃度較高，但很快便被清除，清除率CL為0.505L·h-1·Kg-1，平均滯留時(shí)間很短為1.32h，而PEG-SA-ORI衍生物的藥物濃度-時(shí)間曲線則更為平緩，并且在24h時(shí)血液中的冬凌草甲素仍能維持一定水平，PEG10K-SA-ORI的平均滯留時(shí)間達(dá)到14.50h，清除率CL為0.232L·h-1·Kg-1，而PEG20K-SA-ORI的平均滯留時(shí)間達(dá)22.44h，清除率CL為0.230L·

13、h-1·Kg-1。說明聚乙二醇修飾作用可明顯改變小分子藥物的藥物動(dòng)力學(xué)特征，它可通過延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間從而提高藥物的治療效果。
　　本課題將聚乙二醇修飾的方法引入冬凌草甲素前藥的合成中，并對(duì)其合成條件及構(gòu)建方法、工藝與理化性質(zhì)、抗腫瘤活性及動(dòng)物體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)等內(nèi)容進(jìn)行了系統(tǒng)研究。這些新型聚乙二醇化的冬凌草甲素的進(jìn)一步非臨床和臨床評(píng)價(jià)將很有可能為白血病患者帶來一個(gè)有價(jià)值的治療選擇。我們的研究成果同時(shí)也證明聚乙二醇化技術(shù)為小