苛求芽孢桿菌尿酸酶的結(jié)構(gòu)對其熱穩(wěn)定性的影響.pdf

1、重組苛求芽孢桿菌(ATCC29604)胞內(nèi)尿酸酶用于動力學(xué)方法測定血清尿酸有顯著優(yōu)勢，還有治療高尿酸血癥的藥用潛力。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建N端序列為AERTMFYGKGDV的重組尿酸酶，其米氏常數(shù)為(0.22±0.01)mM，初速度法不適合測定其動力參數(shù)；此重組尿酸酶在pH7.4的穩(wěn)定性半衰期約7小時(shí)，且四聚體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。本文首先建立了重組苛求芽孢桿菌尿酸酶動力學(xué)參數(shù)的評價(jià)方法，考察了不同條件下重組表達(dá)的尿酸酶的四聚體結(jié)構(gòu)變化，分析了其單位結(jié)構(gòu)模

2、型的活性中心及其附近靜電作用網(wǎng)絡(luò)，優(yōu)化此靜電網(wǎng)絡(luò)及N端第1到9位殘基、C端296到322位殘基，構(gòu)建了N端、中間點(diǎn)突變體及C端截短共12個(gè)突變體，并表征了所構(gòu)建突變體的性質(zhì)，探索N端、C端序列與此重組表達(dá)尿酸酶熱穩(wěn)定性和高級結(jié)構(gòu)的關(guān)系。
　　1.重組表達(dá)尿酸酶動力學(xué)參數(shù)評價(jià)方法的建立
　　通過初速度法測定了Tris-HCl和硼砂緩沖液中的酶中間產(chǎn)物5-羥異尿酸的干擾，用0.103 U的酶量，300μM的尿酸反應(yīng)，308 nm

3、下測定，在Tris-HCl緩沖液中的5-羥異尿酸的積累較硼砂緩沖液中的嚴(yán)重，pH7.4較pH9.2的嚴(yán)重，200μM的Mg2+加速5-羥異尿酸的分解。尿酸對二甲基酚橙法測定尿酸酶米氏常數(shù)在Tris-HCl緩沖液中有負(fù)干擾，在硼砂緩沖液中有正干擾，可能是由于Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基會誘發(fā)尿酸氧化而造成二價(jià)鐵離子氧化，但加入消除羥自由基的0.5M甘露醇和0.5M甲酸鈉并不能消除干擾。通過初速度法測定308 nm吸收時(shí)，隨著加入酶量降低中

4、間產(chǎn)物積累的干擾減弱，測得pH7.4，8.2and9.2的Km分別逐漸趨于0.17±0.02 mM(n=3)，0.34±0.02mM(n=3)，0.35±0.01mM(n=3)。因分析反應(yīng)過程對起點(diǎn)的不確定度有抗性，采用積分法測定黃嘌呤和氧嗪酸鉀的Ki。初速度法測定尿酸為75μM，300μM，600μM時(shí)，酶的最適溫度為分別為10℃、20℃、20℃。二甲基酚橙法測定尿酸濃度為75μM，300μM，600μM時(shí)最適溫度分別為10℃、20℃

5、、30℃。可能由于有熵效應(yīng)的存在，此尿酸酶的最適溫度在30℃。幾種方法測得其最適pH值均在9.0附近。
　　2.不同條件下N端為AERTMFYGK重組尿酸酶的四級結(jié)構(gòu)變化
　　-20℃凍存3個(gè)月以后造成重組尿酸酶四聚體結(jié)構(gòu)逐漸解聚為二聚體，伴隨著酶的比活性降低，-20℃凍存6個(gè)月的樣品主要以二聚體為主。在37℃，pH7.4和9.2的硼砂緩沖液中當(dāng)其比活性降為原來的1/10以下時(shí)，可溶性部分僅有四聚體，而體系出現(xiàn)肉眼可觀察到的

6、不溶性沉淀；非變形PAGE分離所得四聚體仍然保留催化活性，但其比活性降低；新鮮制備的此重組尿酸酶在pH7.4.的半衰期為50 h，但凍存后明顯縮短。
　　3.配體增強(qiáng)N端為AERTMFYGK的重組尿酸酶熱穩(wěn)定性
　　非變性PAGE分析發(fā)現(xiàn)此重組表達(dá)尿酸酶低溫凍存后形成二聚體；經(jīng)400μM尿酸，120μM黃嘌呤或30μM氧嗪酸鉀誘導(dǎo)之后轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘乃木垠w，且經(jīng)親和力較強(qiáng)的氧嗪酸鉀作用之后，重組表達(dá)的尿酸酶在pH7.4的的半衰

7、期可延長到150個(gè)小時(shí)左右。
　　4.苛求芽孢桿菌N端C端結(jié)構(gòu)對其穩(wěn)定性的影響
　　據(jù)已有N端為AERTMFYGK的基因序列的重組表達(dá)載體的同源建模的模型，分析了活性中心及其附近靜電作用網(wǎng)絡(luò)，優(yōu)化此靜電網(wǎng)絡(luò)及N端第1到9位殘基、C端296到322位殘基，構(gòu)建系列N端、中間點(diǎn)突變體及C端截短共12個(gè)突變體，設(shè)計(jì)合成突變引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，克隆突變體。N端7個(gè)突變體重組表達(dá)尿酸酶比較發(fā)現(xiàn)N端序列對其Ki、Km及最適溫度和最適pH

8、影響較小，而前三個(gè)氨基酸對其比活性和穩(wěn)定性影響顯著：其中N端突變體ADD，SQR，QQG的比活性分別為0.01U、1.64U、0.153U，經(jīng)非變性PAGE電泳可見以二聚體為主，而N端為QER，QQR，VQR的比活性分別為7.0U、7.2U、9.3U，經(jīng)非變性PAGE電泳可見以四聚體為主，QER，QQR，VQR在pH7.4的體外半衰期分別為350，450，200小時(shí)左右，N端前三個(gè)氨基酸對其比活性及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起重要作用，N端的ADD，A