棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因克隆和在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、木霉菌（Trichoderma spp.）是一種應(yīng)用前景廣闊的植物病害生物防治菌，含有很多優(yōu)良的生物防治基因，棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因就是其中之一。天冬氨酸蛋白酶（aspartic proteinase）是一類重要的蛋白水解酶，參與機(jī)體的新陳代謝及生物調(diào)控作用。它的活性中心由兩個(gè)催化性天冬氨酸殘基組成。能夠降解抗原，促進(jìn)其他酶的活化，位點(diǎn)特異性水解逆轉(zhuǎn)錄酶病毒前體蛋白以產(chǎn)生病毒體復(fù)制所必須的酶蛋白等等。天冬氨酸蛋白酶廣泛存在于病毒、真

2、菌、哺乳動(dòng)物及植物中，參與多種生理過(guò)程。天冬氨酸蛋白酶在生物防治等方面具有巨大的應(yīng)用潛力。
　　為了利用重組天冬氨酸蛋白酶生產(chǎn)廣譜抗性的生物農(nóng)藥，本研究采用易于培養(yǎng)、外源蛋白表達(dá)量高的畢赤酵母（Pichia pastoris）作為表達(dá)生產(chǎn)工具，從已構(gòu)建好的質(zhì)粒 p1762-mAsp中通過(guò)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增出棘孢木霉的mAsp基因，將經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切的mAsp基因和酵母表達(dá)載體pPIC9K進(jìn)行體外連接，構(gòu)建酵母重組表達(dá)載

3、體，經(jīng)過(guò)菌液PCR檢測(cè)，雙酶切檢測(cè)并測(cè)序，得到有正確閱讀框的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-mAsp。
　　將pPIC9K-mAsp和pPIC9K空質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Sac I線性化后，采用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化 GS115酵母感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)甲醇利用表型的篩選和PCR檢測(cè)篩選得到2株高效利用甲醇和1株低效利用甲醇的GS115型陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。通過(guò)檢測(cè)各轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液上清每隔24h的蛋白表達(dá)情況和酶活情況篩選出高效表達(dá)天冬氨酸蛋白酶的工程菌株G

4、a-2和Ga-5。
　　對(duì)兩株工程菌株分泌的重組mAsp粗酶液進(jìn)行了酶活測(cè)定與酶學(xué)特性研究，同時(shí)對(duì)于重組mAsp的抑菌性進(jìn)行了初步摸索。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子 Ga-2和Ga-5的產(chǎn)酶高峰出現(xiàn)在3d左右。確定酶系統(tǒng)發(fā)揮活性的最佳組合，即溫度40℃，pH值4.0，依照該體系以酪氨酸為底物測(cè)得的重組蛋白酶發(fā)酵液酶活能達(dá)到31.6μ/g。
　　重組天冬氨酸蛋白酶粗酶液對(duì)稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的生長(zhǎng)具有一定抑制作用，從

5、而證明了重組蛋白酶具有一定的抑菌能力。用觀察菌絲團(tuán)大小的方法進(jìn)行重組天冬氨酸蛋白酶粗酶液對(duì)病原菌抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示其對(duì)稻瘟病菌菌絲團(tuán)的生長(zhǎng)具有一定抑制作用，為今后的抑菌研究提供了新的方法，也為生物農(nóng)藥酶制劑研究打下基礎(chǔ)。
　　棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶能在畢赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白，而且表達(dá)產(chǎn)物同樣具有抑制真菌生長(zhǎng)的優(yōu)良特性，這就預(yù)示了表達(dá)天冬氨酸蛋白酶在工業(yè)和生物學(xué)領(lǐng)域的廣闊應(yīng)用前景。因此，期望能對(duì)該基因進(jìn)行改造，尋找合適