黃粉蟲(chóng)絲氨酸胰蛋白酶樣酶的基因克隆及在畢赤酵母中的表達(dá)和活性檢測(cè).pdf

1、黃粉蟲(chóng)(TenebriomolitorL.)在昆蟲(chóng)分類(lèi)學(xué)上隸屬于鞘翅目，擬步行蟲(chóng)科，粉蟲(chóng)甲屬。目前有關(guān)研究已經(jīng)證明，黃粉蟲(chóng)體內(nèi)含有多種重要生物活性物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、微量元素和維生素等;大量實(shí)驗(yàn)也證明，以黃粉蟲(chóng)為原料制成的保健品具有提高人體免疫力、抗疲勞、降低血脂、抗癌以及促進(jìn)新陳代謝等功效。目前，國(guó)內(nèi)主要在其生物學(xué)特性和人工養(yǎng)殖技術(shù)方面有所研究，作為一種高蛋白營(yíng)養(yǎng)品，對(duì)其功能性蛋白的研究較為罕見(jiàn)。國(guó)外對(duì)該蟲(chóng)已引起廣泛關(guān)注，

2、已有對(duì)其消化酶的有關(guān)研究，和少量關(guān)于其具有抑菌和溶血栓作用方面的工作，但對(duì)黃粉蟲(chóng)胰蛋白酶樣酶的提取、功能以及其基因方面的研究尚少，而對(duì)該基因的克隆表達(dá)的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本論文的研究是在課題組前期對(duì)其纖溶酶基因進(jìn)行克隆的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討黃粉蟲(chóng)絲氨酸胰蛋白酶樣酶(TMTLSP)基因克隆并在畢赤酵母中表達(dá)。畢赤酵母是一種甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母，具有高效表達(dá)外源蛋白的能力、完善的分泌系統(tǒng)和翻譯后加工機(jī)制，適于表達(dá)真核蛋白。
　　 本文采用了P

3、CR技術(shù)，以含有TMTLSPcDNA的質(zhì)粒作為模板，擴(kuò)增出TMTLSP基因片段;將克隆獲得的目的基因插入到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K中，經(jīng)測(cè)序無(wú)誤后，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-TMTLSP;將重組表達(dá)質(zhì)粒線性化后電擊轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中，經(jīng)篩選并PCR驗(yàn)證獲得多拷貝整合型酵母工程菌;對(duì)工程菌進(jìn)行發(fā)酵，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示在26KD左右有陽(yáng)性條帶，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子沒(méi)有;經(jīng)纖溶平板實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該表達(dá)蛋