半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1的活化在哮喘氣道炎癥中作用的研究.pdf

1、研究背景：支氣管哮喘（簡稱哮喘）是全球范圍內常見的慢性呼吸道疾病，近年來在世界各國均有逐年上升的趨勢，已成為嚴重威脅人類健康的一類疾病。據統(tǒng)計，全球約有3億哮喘患者，全球患病率1％～18％，我國約有1000～3000萬哮喘患者，并有不斷增加的趨勢。哮喘是一種由基因與環(huán)境因素共同導致的復雜疾病。盡管哮喘基礎研究已取得較大的進步，但目前發(fā)病機制和發(fā)展環(huán)節(jié)尚未完全明確，臨床上對于哮喘的急性加重以及重癥哮喘的治療亦不是很滿意。因此，探討哮喘氣道

2、炎癥發(fā)病機制、尋找新的治療或預防靶點是呼吸系統(tǒng)疾病研究重點和熱點。
　　 支氣管哮喘是一種以氣道慢性炎癥、粘液分泌增加、氣道重塑及氣道反應性增高為主要特征的免疫變態(tài)反應性疾病。其中，氣道炎癥為最主要的病理變化，并決定氣道阻塞和氣道高反應性的程度。隨著研究的不斷拓展和深入，關于哮喘發(fā)病機制的假說不斷增多，得到最廣泛關注的是哮喘發(fā)病的“衛(wèi)生學假說”，其核心為Th1/Th2失衡。該學說認為哮喘的發(fā)生是由于體內Th1/Th2平衡失調所致

3、，即正常人以Th1/Th2保持平衡，但哮喘患者體內則Th0向Th2分化過度，使Th2占優(yōu)勢。Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的重要基礎，Th2優(yōu)勢是過敏性哮喘形成及進展的關鍵性機制。除了炎癥細胞和炎癥介質，氣道結構細胞特別是氣道上皮細胞也參與氣道炎癥的發(fā)生與發(fā)展，氣道上皮細胞(HBE)首先作為氣道的第一道防線抵抗外來侵害，同時在氣道固有免疫中也發(fā)揮著重要作用(一)研究證明HBE是哮喘聯系固有免疫與獲得性免疫的橋梁。隨著對炎癥性疾病的深入研究

4、以及對炎癥通路的逐步了解，炎癥復合體(inflammasome)成為多種炎癥性疾病的研究重點，其中研究最多的就是NLRP3炎癥復合體。NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain-leucine-rich repeats containing pyrindomain3)炎癥復合體是由NLRP3蛋白、凋亡相關點樣蛋白(ASC)和Caspase-1組成的多蛋白復合體。NLRP3蛋白能通過AS

5、C接合半胱氨酸天冬氨酸酶-1前體pro-Caspase-1(45KDa)組裝成NLRP3炎癥復合體，組裝后的pro-Caspase-1能自動激活形成有活性的Caspase-1，活化的Caspase-1(10KDa和20KDa)促進IL-1家族細胞因子（IL-1β，IL-18，IL-33等）成熟與分泌，從而參與炎癥反應。
　　 為了揭示NLRP3炎癥復合體組裝后激活的Caspase-1在哮喘氣道炎癥的作用機制，本研究選擇了C57B

6、L/6小鼠和人氣道上皮細胞(16HBE)作為研究對象，觀察在哮喘小鼠模型以及人氣道上皮細胞炎癥微環(huán)境中Caspase-1的表達，以及下游細胞因子IL-1家族細胞因子的生成，并通過Ac-YVAD-cmk阻斷Caspase-1活化觀察其是否可以引起IL-1家族細胞因子表達的改變，從而為完善哮喘氣道炎癥機制研究及治療方法上提供參考。
　　 第一部分小鼠哮喘模型建立
　　 目的：建立OVA致敏和激發(fā)雌性C57BL/6小鼠哮喘模型

7、。
　　 方法：SPF級雌性C57BL/6小鼠（南方醫(yī)科大學實驗動物中心）18只，6-8周，體重18～20g，隨機分為3組，對照組（A組）、哮喘組（B組）和Caspase-1特異性抑制劑(Ac-YVAD-cmk)組（C組），B、C組小鼠于實驗流程第0天、7天、14天給予腹腔注射雞卵蛋白(OVA)液200μl致敏，A組僅用生理鹽水替代致敏。B、C組小鼠于第21-27天霧化激發(fā)，給予2％ OVA40ml，經超聲霧化器霧化吸入30mi

8、n，1次/天; C組每次激發(fā)前30min給予Ac-YVAD-cmk溶液5μg/g腹腔注射;對照組用生理鹽水代替OVA霧化激發(fā)。術次激發(fā)24h后，各組小鼠霧化吸入乙酰甲膽堿，用BUXCO無創(chuàng)肺功能檢測儀記錄氣道反應性監(jiān)測指標增強呼氣間歇(Penh)值。第29天采用水合氯醛麻醉小鼠，摘眼球放血處死，75％酒精消毒，行支氣管肺泡灌沈術，回收BALF，離心取細胞沉渣，重懸充板行細胞計數;涂片，瑞氏染色，細胞分類計數;取右上肺組織4％多聚甲醛固定

9、，酒精脫水，石蠟包埋，常規(guī)HE染色，光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)，氣管和血管周圍炎癥細胞浸潤情況。
　　 結果：
　　 1.致敏、激發(fā)哮喘過程小鼠行為學觀察:B組、C組誘發(fā)哮喘后后出現不同程度呼吸急促、立毛、前肢搔鼻和煩躁不安，然后出現口唇紫紺、呼吸急促、二便失禁、活動度減低等癥狀，而A組未見上述癥狀。
　　 2.無創(chuàng)肺功能檢測氣道反應性結果:當乙酰甲膽堿濃度為3.125g/L、12.5g/L、25g/L和50g/L

10、時，各組Penh值比較，B組明顯高于A組和C組，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 3.BALF中細胞總數和嗜酸性粒細胞、淋巴細胞百分比:①BALF細胞計數:B組BALF細胞總數(28.43±3.45)×104/ml，高于A組（9.01±2.33）×104/ml和C組（22.89±4.61）×104/ml(F=46.682，P=0.000)。②BALF嗜酸性粒細胞百分數:B組嗜酸性粒細胞百分比為（22.35±4.91）％，明顯高于A組（1

11、.07±0.20）％和C組（13.58±2.13）％(F=71.916，P=0.000)。③BALF淋巴細胞百分數:B組淋巴細胞百分比為（32.32±6.12）％，明顯高于A組(10.76±2.02)％和C組（18.50±3.18)％(F=34.688,P=0.000)。
　　 4.肺組織病理學觀察:A組小鼠肺組織細支氣管和肺泡結構清晰，未見明顯炎癥浸潤;B組小鼠細支氣管壁和周圍有大量炎癥細胞浸潤，主要為淋巴細胞，支氣管腔內可見

12、粘液分泌，C組小鼠細支氣管壁和周圍可見炎癥細胞浸潤，杯狀細胞增生，但與哮喘組相比，支氣管和血管周圍炎癥明顯減輕。
　　 結論：雌性C57BL/6小鼠OVA聯合鋁劑腹腔注射致敏后，再用OVA霧化激發(fā)的方法成功建立小鼠哮喘模型，出現哮喘癥狀和氣道反應性增加，符合哮喘氣道炎癥的病理生理改變。
　　 第二部分哮喘小鼠肺部Caspase-1表達和IL-1β、IL-33生成
　　 目的：觀察哮喘小鼠肺部Caspase-1表達

13、和下游細胞因子IL-1β、IL-33的成熟與分泌，探討可能的機制。
　　 方法：取3組動物肺組織標本各3份，1份采用Trizol試劑提取總RNA，逆轉錄為互補脫氧核糖核酸(cDNA)，以此為模板行PCR擴增。采用實時熒光定量PCR(real time quantitative-PCR)檢測Caspase-1 mRNA表達水平;1份加預冷的含蛋白酶抑制劑(PMSF)的RIPA裂解液，冰磨3～5min，離心取上清，BCA法測定蛋白含

14、量，繪制標準曲線，計算蛋白濃度，SDS-PAGE電泳和免疫印記反應，半干法轉膜，顯色，曝光，1mage J軟件分析;1份用預冷的PBS沖洗后濾紙吸干，稱重，剪刀剪碎后，加入PBS液，冰磨2min，離心取上清，BCA法測定蛋白含量，參照試劑盒說明書進行IL-1β、IL-33的檢測。
　　 結果：
　　 1.小鼠肺組織中Caspase-1 mRNA的表達:每個樣本的Caspase-1的相對mRNA表達水平直接用樣品各自管家基

15、因GAPDH的表達來標準化初始mRNA量。以2-ΔΔCt值比較，A組（2.12±1.33）和C組（5.99±4.20）均低于B組（15.97±8.67），差異有統(tǒng)計學意義。(F=10.653，P=0.004)。
　　 2.小鼠肺組織Caspase-1蛋白的表達:通過Image J軟件分析B組Caspase-1/β-actin（0.56±0.03）較A組(0.47±0.03)和C組（0.28±0.03）明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(

16、F=73.916，P=0.000)3.IL-1β和IL-33的分泌: B組肺組織勻漿上清IL-1β（76.49±9.43）pg/mg及IL-33（73.08±6.67）pg/mg含量均高于A組[(37.51±9.13)pg/mg，P＜0.05;(32.79±5.92)pg/mg, P＜0.05）和C組[(64.74±8.65)pg/mg, P＜0.05;(46.94±2.38)pg/mg, P＜0.05)。
　　 結論：Casp

17、ase-1活化及其下游IL-1家族細胞因子（IL-1β，IL-33）增加并參與哮喘氣道炎癥。
　　 第三部分脂多糖誘導人氣道上皮細胞Caspase-1表達
　　 研究目的：觀察LPS誘導人氣道上皮細胞過程中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)表達情況。
　　 方法：16HBE細胞復蘇后以RPMI-1640（含10％胎牛血清）為基本培養(yǎng)液，0.25％含EDTA的胰蛋白酶消化傳代，每周傳代2-3次。2×1

18、05/ml接種于6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24h后貼壁，用PBS液和無血清RPMI-1640培養(yǎng)基清洗，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中無血清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，用LPS(10μg/ml)預先將16HBE細胞致敏，制備氣道上皮細胞哮喘模型，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h，PBS液為空白對照，LPS組加LPS（10μg/ml）培養(yǎng)24 h;LPS+組Caspase-1特異性抑制劑(Ac-YVAD-cmk)（以下簡稱LPS+cmk組）先用

19、Ac-YVAD-cmk（10μmol/L）預處理，1h后再加入LPS(10μg/ml)培養(yǎng)至24h。四氮唑鹽(MTT)法測定各組細胞增殖能力，RT-PCR檢查各組細胞Caspase-1 mRNA的表達，western blot檢測各組細胞Caspase-1蛋白表達，ELISA檢測各組細胞上清液中IL-1β的生成。
　　 結果：
　　 1.MTT檢測及OD值測定:三組人氣道上皮細胞MTT檢測及OD值測定。陰性對照組OD值為

20、0.57±0.10，LPS組OD值為0.54±0.06，LPS+cmk組OD值為0.51±0.08，各組OD值比較P＞0.05(P=0.611，F=0.520)，各組細胞增殖無顯著差異。
　　 2.各組細胞Caspase-1 mRNA的表達:以2的-ΔΔCt次方比較，對照組（1.33±0.33）和LPS+cmk組（1.50±0.24）均低于LPS組（3.11±0.57），各組間差異有統(tǒng)計學意義(F=17.564，P=0.003)

21、。
　　 3.各組細胞Caspase-1蛋白的表達:以灰度掃描結果（Z值）比較，LPS組為0.85±0.11，LPS+cmk組為0.48±0.06，對照組為0.24±0.03。LPS+cmk組與對照組Z值均小于LPS組，差異有統(tǒng)計學意義(F=55.158，P=0.000)。
　　 4.各組細胞上清液IL-1β含量變化:與LPS組[(52.34±2.47)pg/ml]相比，陰性對照組[(15.73±6.83)pg/ml]和