鐮形扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶的鑒定及其在唾液腺細胞凋亡中的作用研究.pdf

1、半胱氨酸蛋白酶是一類古老而又保守的蛋白酶，其分布廣泛，涵蓋范圍從病毒、細菌到哺乳動物的各個組織器官，參與胚胎發(fā)育，抗原呈遞，細胞凋亡和穩(wěn)態(tài)維持等多種重要的生理活動。作為專性體表寄生蟲，蜱以吸血宿主血液為生，在其吸血過程中可傳播細菌、真菌、病毒、支原體、原蟲等多種病原體，是重要的人畜共患病傳播媒介。唾液腺是宿主血液進入蜱體內(nèi)最先接觸的組織器官，也是蜱體內(nèi)病原體傳播到宿主體內(nèi)的通道，因此蜱唾液腺重要分子的研究對于蜱及蜱傳病控制十分重要；隨著

2、吸血過程的完成，蜱的唾液腺逐漸萎縮，這一現(xiàn)象是由細胞凋亡引起的，但分子機制不清。本研究以蜱的唾液腺中半胱氨酸蛋白酶分子群的鑒定為切入點，探索了半胱氨酸蛋白酶在唾液腺發(fā)育與凋亡中的作用機制。
　　以鐮形扇頭蜱為研究對象，對吸血前、后唾液腺轉(zhuǎn)錄組進行測序及差異分析，分別測得上調(diào)基因1179個，下調(diào)基因574個，其中總轉(zhuǎn)錄庫中預測的半胱氨酸蛋白酶表達序列標簽（EST）有25個（13個上調(diào)基因EST，1個下調(diào)基因EST）；經(jīng)過基因克隆，共

3、獲得6個半胱氨酸蛋白酶全長序列，根據(jù)基因結(jié)構(gòu)和生物信息學分析，分別命名為組織蛋白酶 B(CATB)、組織蛋白酶L(CATL)、半胱天冬氨酸蛋白酶-1(CASP1)、半胱天冬氨酸蛋白酶-8(CASP8)、自噬相關蛋白酶4B(ATG4B)和自噬相關蛋白酶4D(ATG4D)。
　　通過Real-time PCR方法檢測了6種半胱氨酸蛋白酶在蜱不同發(fā)育階段和不同吸血狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示幼蜱和若蜱吸血后所有蛋白酶的轉(zhuǎn)錄量均顯著性下調(diào)，而

4、在成蜱則全部顯著性上調(diào)；6種蛋白酶在成蜱唾液腺中吸血后轉(zhuǎn)錄量上調(diào)，尤其是CATB和CATL，上調(diào)差異非常顯著，而在其他組織器官中轉(zhuǎn)錄水平各有不同。對5種半胱氨酸蛋白酶進行了體外重組蛋白表達和純化（CASP8未表達），并分別制備小鼠特異抗血清。重組蛋白的酶活實驗顯示，各蛋白在適度濃度和PH范圍內(nèi)均表現(xiàn)一定的活性：CASP1的最適PH為5.5，可達陽性對照酶活性的60％；組織蛋白酶B和L隨著濃度的增加，其活性受到抑制，其中組織蛋白酶L包含一

5、個60個氨基酸的抑制結(jié)構(gòu)域，將其切除后可明顯提高組織蛋白酶L的活性，推測抑制結(jié)構(gòu)域是限制組織蛋白酶L活性的重要因素，而組織蛋白酶 B的高濃度抑制效應可能來自酶與底物的競爭；ATG4B和ATG4D對CASP1特異性底物具有一定活性，可達陽性對照的40%，ATG4D對組織蛋白酶特異性底物具有良好活性，高濃度下也出現(xiàn)抑制效應。5種重組蛋白的特異性抗血清，可分別識別成蜱體內(nèi)天然蛋白酶，其中兩種組織蛋白酶CATB和CATL在35~40 kDa之間

6、均有2條帶，可能為酶原和激活態(tài)，而自噬相關蛋白酶天然蛋白大小分別為~36 kDa(ATG4B)和~40 kDa(ATG4D)，CASP1天然蛋白大小約為37 kDa，在70 kDa左右有類似二聚體結(jié)構(gòu)，可能是其真正的活性態(tài)。利用免疫組化技術，觀察5種半胱氨酸蛋白酶在唾液腺和腸腔中的定位，結(jié)果顯示在唾液腺中5種蛋白酶分布廣泛，而在中腸只可見ATG4D的少量分布。
　　利用RNA干擾技術，通過電轉(zhuǎn)化將合成的特異性雙鏈RNA導入鐮形扇頭

7、蜱若蜱體內(nèi)，對6種半胱氨酸蛋白酶分別進行單一干擾實驗，檢測6種半胱氨酸蛋白酶之間是否存在相互作用關系，結(jié)果顯示任一蛋白酶受到抑制均可引起其他5種蛋白酶轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，特別是當CATB和CATL轉(zhuǎn)錄受抑制可引起ATG4B和CASP1轉(zhuǎn)錄水平顯著性上調(diào)，而CASP8和ATG4D轉(zhuǎn)錄受抑制時也引起CASP1轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)；當CASP1受到抑制后，CATB的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)顯著， ATG4D、ATG4B和CASP8的轉(zhuǎn)錄水平也受到明顯

8、抑制，但CATL的轉(zhuǎn)錄水平未受到影響，推測CASP1對于CASP8，CATB，ATG4B和ATG4D可能具有上游調(diào)節(jié)作用，為后續(xù)研究提供了切入點。
　　通過解剖觀察、Tunnel染色和AnnexinⅤ細胞凋亡流式檢測確定了成蜱吸血過程中細胞凋亡參與唾液腺的變化過程；為了探究半胱氨酸蛋白酶在過程中的作用機制，利用顯微注射技術將體外合成的干擾用CASP1雙鏈RNA注射入鐮形扇頭蜱成蜱體內(nèi)，24小時后接種新西蘭大白兔，分別對上體后1到7

9、天的對照組與實驗組成蜱唾液腺進行分離觀察，在mRNA和蛋白水平上檢測7天吸血過程中半胱氨酸蛋白酶的動態(tài)變化，利用Tunnel細胞凋亡染色和AnnexinⅤ流式細胞凋亡檢測技術對吸血過程中唾液腺的變化進行監(jiān)測，結(jié)果表明進入快速吸血期前（上體3~4天）是唾液腺細胞誘導細胞凋亡發(fā)生的主要時相，隨后隨著吸血過程快速完成，唾液腺細胞逐漸壞死，CASP1作為效應性半胱天冬氨酸蛋白酶，在上體后5到7天表達量逐漸增加；CASP1的干擾可明顯延長唾液腺細