施毛蟲半胱氨酸蛋白酶抑制因子TsCystatin1的克隆、表達(dá)及鑒定.pdf

1、旋毛蟲是一種細(xì)胞內(nèi)寄生性線蟲,其生活史可以在同一宿主內(nèi)完成,宿主感染譜極廣,幾乎所有的哺乳動(dòng)物均可感染。旋毛蟲感染引起的旋毛蟲病是一種危害極其嚴(yán)重的食源性人獸共患寄生蟲病。半胱氨酸蛋白酶抑制因子是一類廣泛存在于生物體的半胱氨酸蛋白酶高效內(nèi)源性抑制劑。寄生蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑在寄生蟲逃避宿主免疫應(yīng)答、適應(yīng)寄生生活中發(fā)揮著重要作用。寄生性線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑具有明顯的免疫調(diào)控作用,在寄生蟲入侵宿主時(shí)對(duì)宿主免疫應(yīng)答的抑制起重要作用,是誘

2、導(dǎo)宿主免疫抑制的重要因子之一。
　　 本研究根據(jù)旋毛蟲半胱氨酸蛋白酶抑制因子基因(TsCystatinl)EST序列設(shè)計(jì)引物為上游引物,以PolyT為下游引物對(duì)旋毛蟲新生幼蟲總RNA進(jìn)行RT-PCR,克隆獲得具有完整開放閱讀框(ORF)的TsCystatinl cDNA序列。序列分析結(jié)果表明TsCystatinl基因開放閱讀框?yàn)?69 bp,編碼221個(gè)氨基酸,具有典型的半胱氨酸蛋白酶抑制因子保守氨基酸序列。旋毛蟲基因組DNA分

3、析表明該基因由兩個(gè)外顯子和一個(gè)80 bp的內(nèi)含子組成。對(duì)旋毛蟲成蟲、新生幼蟲以及旋毛蟲感染不同時(shí)期的肌幼蟲分別進(jìn)行RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR,結(jié)果表明該基因在旋毛蟲各個(gè)發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)。將TsCystatinl基因克隆到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1,構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-TsCystatinl,重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳分析表明,該基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中得到了高效表達(dá),產(chǎn)物分子量約