柑橘綠霉病菌轉(zhuǎn)錄因子PacC、Crz1及蛋白激酶SNF1的功能分析.pdf

1、柑橘綠霉病菌(Penicillium digitatum)引起的柑橘腐爛病是貯藏期最主要病害，在柑橘采后包裝、儲存、運(yùn)輸和銷售等過程中，造成的損失約占全部損失的90％。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，通過基因功能缺失和互補(bǔ)的方法，研究了柑橘綠霉病菌中pH信號途徑轉(zhuǎn)錄因子PacC，Ca2+/鈣調(diào)素信號途徑轉(zhuǎn)錄因子Crz1以及蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶SNF1在柑橘綠霉病菌發(fā)育和致病等過程中的作用，結(jié)果如下:
　　 1.PdPacC參與

2、柑橘綠霉病菌響應(yīng)Na+脅迫、利用果膠和致病性
　　 序列比對和分析發(fā)現(xiàn)柑橘綠霉病菌中存在與構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)類似的pH信號響應(yīng)途徑，該信號途徑的末端轉(zhuǎn)錄因子PdPacC含有641個氨基酸，存在與構(gòu)巢曲霉AnPacC相似的3個鋅指結(jié)構(gòu)域(57～145位，從起始密碼子起，下同)以及信號蛋白酶識別位點(diǎn)(461～484位)，在啟動子區(qū)(-222bp到-723bp)含有4個PacC自身結(jié)合位點(diǎn)(5'-GC

3、CARG-3')。表達(dá)分析表明中性和堿性條件(pH≥7)、Na+脅迫和果膠處理均可誘導(dǎo)PdPacC，而在侵染過程中其表達(dá)不受果皮酸性pH環(huán)境影響，在感染初期呈現(xiàn)明顯的升高，48后為對照條件(PDB中培養(yǎng))的8.4倍。PdPacC缺失突變體對Na+、K+的敏感性增加，喪失在堿性條件(pH=8.0）下的生長能力，對果膠的利用能力下降，對柑橘果實(shí)的致病能力也顯著下降，產(chǎn)生的病斑直徑只有野生型的56.3％。而將功能PdPacC重新導(dǎo)入缺失突變體

4、時，缺失突變體表型缺陷恢復(fù)。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在侵染過程中與野生型相比△PdPacC突變株內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶(PG2）和果膠裂解酶(PNL1)的上升表達(dá)喪失，進(jìn)一步分析表明△PG2突變株引起的病斑直徑只有野生型的70％。綜上所述，PdPacC參與對Na+、K+及堿性脅迫的適應(yīng)，并通過調(diào)控細(xì)胞壁水解酶影響致病性。
　　 2.PdCrz1參與柑橘綠霉病菌的產(chǎn)孢、細(xì)胞壁合成、致病和對DMI類藥劑的抗性
　　 轉(zhuǎn)錄因子Crz1是受鈣

5、調(diào)磷酸酶調(diào)控的Cys2His2鋅指轉(zhuǎn)錄因子，能夠響應(yīng)外界的環(huán)境脅迫。本研究結(jié)果表明，柑橘綠霉病菌中的Crz1基因能夠編碼760個氨基酸的蛋白，其C末端含有2個保守的Cys2His2型鋅指結(jié)構(gòu)域(522～574位)?！鱌dCrz1突變株的產(chǎn)孢能力、致病性下降，對剛果紅、SDS和細(xì)胞壁降解酶的敏感性增加，且細(xì)胞壁松散。同時，△PdCrz1突變株對Ca2+和H2O2的敏感性增加。表達(dá)分析表明Ca2+能夠誘導(dǎo)野生型中鈣離子ATP酶基因PMC1和

6、PMR1，細(xì)胞壁合成酶基因FKS1、CHS2和CHS3的表達(dá)，而在△PdCrz1突變株中這些基因的上調(diào)表達(dá)喪失?！鱌dCrz1突變株對DMI類殺菌劑的敏感性增加，鈣調(diào)磷酸酶抑制劑能夠增強(qiáng)DMI類殺菌劑的活性，而且低濃度的Ca2+(≤0.2M）能夠提高柑橘綠霉病菌對DMI類殺菌劑的抗性。這些結(jié)果表明PdCrz1對柑橘綠霉病菌的產(chǎn)孢、致病性以及DMI類殺菌劑的抗性有重要的作用，鈣調(diào)磷酸酶信號途徑的抑制劑與DMI類藥劑具有協(xié)同的抗菌作用，表明

7、鈣調(diào)磷酸酶信號途徑的抑制劑可作為DMI類殺菌劑的增效劑具有潛在的應(yīng)用價值。
　　 3.PdSNF1參與柑橘綠霉病菌的碳源利用、產(chǎn)孢和致病性
　　 蛋白激酶SNF1能夠激活葡萄糖抑制基因的表達(dá)，對病原微生物適應(yīng)外界環(huán)境的營養(yǎng)脅迫和致病性有重要的作用。本研究表明，柑橘綠霉病菌中的SNF1基因能夠編碼789個氨基酸的蛋白，其N端含有一個保守的蛋白激酶區(qū)(65～316位)?！鱌dSNF1突變株在含有果膠或多聚半乳糖醛酸的單碳源培

8、養(yǎng)基上生長嚴(yán)重缺陷，對柑橘果實(shí)的致病性下降，接種5d后的病斑直徑只有野生型菌株的63％。表達(dá)分析表明經(jīng)60h的果膠誘導(dǎo)培養(yǎng)，野生型菌株中細(xì)胞壁水解酶:木聚糖酶(XY1)、果膠酶(PL1)、果膠裂解酶(PNL1)和外切多聚半乳糖醛酸酶(EXPG2)的表達(dá)分別升高15.5、12.9、21和12.3倍，而△PdSNF1突變株中這些細(xì)胞壁水解酶的表達(dá)沒有被誘導(dǎo)升高。由此可見，PdSNF1極可能通過調(diào)控細(xì)胞壁水解酶而調(diào)控對果膠等碳源的利用，從而影