柑橘褐斑病菌比較基因組和轉錄組分析及柑橘綠霉病菌產(chǎn)孢中心調控途徑和高滲甘油途徑的功能基因研究.pdf

1、一、柑橘褐斑病菌比較基因組和轉錄組分析
　　柑橘褐斑病(Alternaria brown spot，ABS)是部分重要橘，以及這些橘和柚或橘和橙雜交柑橘上的重要病害，引起落葉、落果、枯梢，帶病果實無法鮮銷，常給感病的柑橘品種生產(chǎn)帶來巨大困難。柑橘褐斑病的病原為交鏈格孢菌橘致病型(A.alternata pathotype tangerine，也稱A.alternata pv.citri)，已有的研究發(fā)現(xiàn)該病原菌能夠產(chǎn)生寄主選擇性A

2、CT毒素，而該毒素是病菌致病所必需的;同時還發(fā)現(xiàn)活性氧解毒系統(tǒng)在病菌致病中也有重要的作用。然而，目前對柑橘褐斑病菌毒素的合成和調控過程以及抗氧化調控網(wǎng)絡仍缺乏深入的認識，對該病菌的基礎代謝過程，如生長和繁殖，對環(huán)境的適應以及次生代謝物產(chǎn)生等方面的研究也很少。深入研究柑橘褐斑病菌的生長、發(fā)育、繁殖、適應、次生代謝等基礎生物學以及致病機理可為探索全新病害防治途徑，改善現(xiàn)有防治策略提供新的思路，而一個完整的基因組信息是開展相關研究的基礎。因此

3、，我們對一個來自浙江甌柑的柑橘褐斑病菌菌株Z7進行了全基因組測序，并與已知其他鏈格孢菌的基因組序列進行了比較，同時還分析了H2O2處理后的轉錄組變化，得到以下結果:
　　1.比較基因組學研究揭示了柑橘褐斑病菌橘致病型的特異基因
　　柑橘褐斑病菌Z7菌株基因組包含161個contigs，總長34.41Mb，平均G+C含量為51.0％。Z7基因組共編碼12062個基因和115個tRNA，平均基因長度1726bp，序列重復率為0.

4、55％。通過不同致病型交鏈格孢菌株直系同源基因的分類與比較，得到10個橘致病型特有的基因。這些基因成簇聚集在基因組上，后續(xù)分析認為它們是合成ACT毒素的關鍵組分，決定了柑橘致病型的分化?；蚪M水平上構建的系統(tǒng)進化樹與Lawrence等提出的鏈格孢屬下劃分4個組的觀點相吻合，為鏈格孢屬真菌新分類系統(tǒng)提供了強有力的支撐。交鏈格孢菌橘致病型基因組中發(fā)現(xiàn)了18個次生代謝基因簇，其中柑橘?；韵嚓P的ACT毒素基因簇長91.2kb，包括25個基因，

5、大部分基因在基因組中都有2～3個拷貝，推測在進化過程中這些基因發(fā)生了復制，也暗示Z7具有較強的產(chǎn)生ACT毒素的能力。柑橘褐斑病菌含有較多的細胞壁降解酶，這與它們死體營養(yǎng)的生活方式相一致。
　　2.比較基因組揭示柑橘褐斑病菌非必需染色體起源于鏈格孢菌的祖先
　　我們用比較基因組的方法，獲得了Z7總長1.88Mb的非必需染色體(Conditionally Dispensable Chromosome，CDC)序列。CDC和EC基

6、因組的組成結構具有明顯的不同，CDC的平均G+C含量是47.7％，序列重復率為1.23％;Z7CDC編碼525個蛋白，不含有tRNA。利用GO數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)CDC上的基因主要富集在‘細胞代謝過程’、‘初級代謝過程’、‘氧化還原反應’和‘大分子代謝過程’等生物學過程。蛋白家族分析表明CDC上含有13個碳水化合物酶，29個分泌蛋白，3個激酶，21個轉錄因子，25個轉運蛋白和13個細胞色素P450單加氧酶。密碼子適應性指數(shù)(CAI)分析表明E

7、C和CDC基因的密碼子偏好性明顯不同，暗示CDC的進化歷史可能與EC不同。通過Ka/Ks分析發(fā)現(xiàn)，CDC上的基因都受到強烈的純化選擇。直系同源聚類發(fā)現(xiàn)接近77％的CDC基因的同源基因至少在5個其他鏈格孢菌種中出現(xiàn)，通過比較由24個鏈格孢菌屬蛋白和29個其他真菌屬的蛋白組成的兩個數(shù)據(jù)庫，超過95％的CDC基因都與鏈格孢菌數(shù)據(jù)庫具有較高的相似性，表明CDC上絕大多數(shù)基因來自于鏈格孢屬真菌的祖先。
　　3.線粒體比較基因組揭示柑橘褐斑病

8、菌與其他種屬線粒體的保守基因在排布上顯示巨大差異
　　柑橘褐斑病菌線粒體基因組大小50，625bp，平均A+T含量為70.8％，含有13個標準的蛋白基因，2個核糖體大小亞基和31個tRNA，線粒體基因組編碼效率為63.7％，整體表現(xiàn)出偏好使用富含A/T的密碼子。腔菌目(Pleosporales)三個菌株線粒體基因組的基因較為保守，但基因的排布則表現(xiàn)出巨大的差異，暗示它們進化歷史不同。用線粒體蛋白構建的不同物種系統(tǒng)進化樹與核基因組構

9、建的進化樹一致，說明雖然線粒體基因相對基因組基因進化速度較快，但總體上與物種進化趨勢吻合。不同真菌線粒體內基因組內含子及基因間區(qū)存在多樣性，是造成線粒體大小差異的重要原因。
　　4.轉錄組分析揭示谷胱甘肽系統(tǒng)、過氧化物酶和轉運蛋白等基因家族在H2O2脅迫適應中發(fā)揮重要作用
　　通過對柑橘褐斑病菌在H2O2處理30min后其轉錄組表達變化分析，發(fā)現(xiàn)1108個上調表達基因和498個下調表達基因。差異表達的基因主要富集在細胞代謝、

10、氧化還原和細胞轉運等生物過程。谷胱甘肽系統(tǒng)、硫氧還蛋白、過氧化氫酶、半胱氨酸過氧化物氧化還原酶等可能是該病菌清除H2O2的主要成員。此外，我們還發(fā)現(xiàn)轉運蛋白、激酶家族、轉錄因子、細胞色素P450、泛素和熱激蛋白等在柑橘褐斑病菌H2O2脅迫適應中發(fā)揮重要作用。在非必需染色體上也有29個基因受到H2O2的明顯誘導，其中包括ACT毒素合成的關鍵基因聚酮合成酶CDCn|11750。
　　二、柑橘綠霉病菌產(chǎn)孢中心調控途徑和高滲甘油途徑的功能

11、基因研究
　　柑橘綠霉病(Penicillium digitatum)是柑橘貯藏、運輸和銷售環(huán)節(jié)中的主要問題，在我國每年因綠霉病導致柑橘損失高達數(shù)百萬噸。迄今，已有3個柑橘綠霉病菌菌株的全基因組公布，但對該病菌的生長發(fā)育、適應和致病等的分子機制了解甚少。形成大量的分生孢子是構成病害流行的基礎，而抵抗適應高滲透勢等逆境脅迫條件是病菌賴以寄生高糖柑橘果實的必要基礎。為了解柑橘綠霉病菌產(chǎn)孢和對滲透勢的適應機制，本文研究了該病菌的brlA

12、、abA和wetA3個產(chǎn)孢中心調控基因和雙組份組氨酸激酶基因os2的生物學功能，取得如下結果:
　　1.PdbrlA、PdabA和PdwetA調控柑橘綠霉病菌產(chǎn)孢的不同階段
　　病菌繁殖產(chǎn)生的大量無性孢子是綠霉病菌病賴以傳播擴散的必要條件。brlA、abaA和wetA是調節(jié)分生孢子形成的重要元件。柑橘綠霉病菌中PdbrlA敲除突變體完全喪失了形成分生孢子梗的能力;PdabaA敲除突變體雖能形成分生孢子梗，但所形成的分生孢子梗

13、畸形，不具有產(chǎn)孢能力;PdwetA的缺失突變體能夠形成正常的分生孢子梗，也可以產(chǎn)孢，但分生孢子的細胞壁明顯疏松，加厚，分生孢子色素不沉積，分生孢子萌發(fā)延遲，病菌對滲透脅迫，去垢劑和熱激反應的耐受性明顯下降，但對H2O2的耐受性卻變強。qRT-PCR結果表明綠霉菌中存在PdbrlA→PdabA→ PdwetA級聯(lián)調控模式，而且這種模式可能存在負反饋調節(jié)機制?；虮磉_譜分析結果表明:與野生型相比，缺失突變體中的401個基因下調表達，144個

14、基因上調表達。Go富集表明下調表達的基因功能主要富集在細胞膜完整性，跨膜轉運和碳水化合物活性等方面，上調的基因主要參與細胞膜轉運的過程。KEGG分析預測PdbrlA與淀粉和蔗糖代謝途徑有關。根據(jù)煙曲霉和構巢曲霉中產(chǎn)孢相關基因的報道，我們在綠霉菌中找到了39個與產(chǎn)孢相關的同源基因。其中，12個基因(abr1、alb1、arp1、arp2、ayg1、asp f4、rodA、rod、ppoC、axl2、abaA和wetA)在PdbrlA中表達

15、明顯下調，2個基因(flbA和fibB)表達明顯上升，12個表達下調的基因啟動子區(qū)都具有brlA和abaA的轉錄結合位點。
　　2.柑橘綠霉病菌通過Pdos2正調控甘油含量、負調控甾醇含量適應高鹽環(huán)境
　　高滲甘油途徑在真核生物體內廣泛存在，對機體適應環(huán)境變化具有極其重要的作用。Os2是該途徑的一個重要激酶，柑橘綠霉病菌△Pdos2突變體對NaCl滲透壓和細胞壁干擾制劑剛果紅和十二烷基苯磺酸鈉的敏感性顯著上升，對氟咯菌腈和異

16、菌脲兩種殺菌劑的抗性也有部分提高，表明Pdos2參與了高滲透脅迫適應、細胞壁完整性和藥劑抗性等生命過程。然而突變體對由H2O2引起的氧化壓的敏感性并沒有明顯改變?！鱌dos2突變體在接種4天后引起的病斑大小相比野生型減少了約25％，表明Pdos2對維持柑橘綠霉病菌的致病性起到部分作用。0.7M NaCl處理后，野生型菌絲體內甘油的含量明顯提高而麥角甾醇的含量卻顯著降低?！鱌dos2突變體菌絲內的甘油含量僅有輕微地上升，而麥角甾醇的含量保