產(chǎn)核黃素Bacillus subtilis中心代謝途徑代謝工程和比較基因組學(xué).pdf

1、本文首先以調(diào)控中心代謝途徑通量為代謝工程策略，研究了戊糖磷酸途徑和糖異生途徑中關(guān)鍵酶基因擾動(dòng)對(duì)枯草芽孢桿菌核黃素合成的影響；其次，利用454 GS FLX高通量測(cè)序系統(tǒng)測(cè)定了核黃素生產(chǎn)菌B.subtilis24和B.subtilisRH33的基因組，實(shí)現(xiàn)了基于全基因組的突變分析和分類，并構(gòu)建了用于突變分析和菌株重構(gòu)的技術(shù)平臺(tái)。
　　 利用定點(diǎn)突變技術(shù)改造C.glutaminum的zwf和gnd基因，得到解除變構(gòu)抑制作用的編碼酶基

2、因zwf243和gnd361。分別表達(dá)zwf243和gnd361時(shí)能夠顯著提高 B.subtilis RH133核黃素的合成，核黃素?fù)u瓶產(chǎn)量分別達(dá)到4.66g/L和4.82g/L，提高了18.0％和22.0％。兩突變基因同時(shí)表達(dá)時(shí)，核黃素?fù)u瓶產(chǎn)量為5.17g/L，葡萄糖限制補(bǔ)料培養(yǎng)核黃素產(chǎn)量為15.7g/L，分別提高了30.9％和39％。基于 LC-MS的胞內(nèi)代謝物譜分析表明，工程菌胞內(nèi)戊糖磷酸途徑代謝物如核黃素及其前體物 AIR、DR

3、L和 Ru5P濃度均比宿主菌顯著增加，提高了15％-46％；相反，三羧酸循環(huán)和糖酵解途徑中的代謝物濃度比工程菌降低。
　　 構(gòu)建了糖異生途徑關(guān)鍵酶基因pckA、gapB和fbp整合型表達(dá)載體pUC18-TPA，pUC18-NPB，pUC18-SPF以及fbp與gapB共表達(dá)載體pUC18-PFB和 fbp，gapB與pckA共表達(dá)載體pUC18-PFBA。以葡萄糖為碳源的搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明，fbp基因的過(guò)表達(dá)對(duì)核黃素的合成影響最大

4、，核黃素產(chǎn)量達(dá)到4.73g/L，提高18％左右；關(guān)鍵酶基因共表達(dá)核黃素發(fā)酵結(jié)果表明，fbp和gapB基因共表達(dá)對(duì)核黃素的合成影響最大，產(chǎn)量提高22％左右，達(dá)到4.89g/L。
　　 利用Roche454 GS FLX系統(tǒng)測(cè)定了核黃素生產(chǎn)菌B.subtilis24和B.subtilisRH33基因組，平均讀長(zhǎng)分別為388bp和394bp，覆蓋率高達(dá)48倍和46倍；結(jié)合Sanger法測(cè)序補(bǔ)齊缺口，組裝全基因組，B.subtilis2

5、4和B.subtilis RH33的全基因組的大小分別為4194978bp和4195221bp，G+C含量均為43.55％。
　　 全基因組的突變分析表明，B.subtilis24中含有突變512個(gè)，其中插入突變29個(gè)，缺失突變20個(gè)，替代突變463個(gè)：B.subtilis RH33中含有突變549個(gè)，其中插入突變31個(gè)，缺失突變24個(gè)，替代突變494個(gè)；兩基因組的比對(duì)分析結(jié)果表明，B.subtilis24和 B.subtili