稻曲病菌侵染特性及產(chǎn)孢相關基因UvPRO1的功能分析.pdf

1、稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）引起的稻曲病是危害水稻生產(chǎn)的重要病害，其產(chǎn)生的稻曲毒素也極大地威脅糧食安全。本研究在組織學水平對稻曲菌在抗、感品種上的侵染差異進行了觀察，研究了稻曲病菌的侵入時期及其侵染過程，利用ATMT方法構建了高效的稻曲病菌突變體庫，從中篩選出產(chǎn)孢相關突變體，并對產(chǎn)孢相關基因UvPRO1進行了功能分析。研究的主要結果如下:
　　1.用GFP熒光標記的稻曲菌分生孢子分別在孕穗期（幼穗分化7-

2、8期）接種抗病品種IR28和感病品種晚秈98，在體式熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察稻益菌在兩個品種穗部的侵染過程。結果表明，接種后6、12、24、48和72h，分生孢子在抗、感病品種穎殼表面的萌發(fā)率分別為11.4％、38.1％、42.5％、56.7％、57.2％和12.7％、36.5％、46.3％、73.4％、75.7％，在接種48h后稻曲菌在抗病品種穎殼上的萌發(fā)率顯著低于感病品種。接種感病品種后3-15d，菌絲首先在穎殼外表面延伸

3、擴展，隨后通過穎殼內外稃之間的縫隙擴展至穎殼內側，并在雄蕊和雌蕊表面定殖，逐步侵染花絲、花藥、花柱和柱頭，并將整個花器包裹在致密的菌絲內，菌絲團進一步膨大，從內外稃之間擠出，形成稻曲球。而在抗病品種上，稻曲菌的侵染過程與感病品種基本一致，但稻曲菌菌絲侵入到抗病品種穎殼內側的比例比感病品種下降了86.9％-92.3％，菌絲侵染抗病品種穎花花柱和柱頭的時間均比感病品種推遲了3d，并且對花柱和柱頭的侵染比例下降了92.2％-95.3％和92.

4、5％-95.7％。在接種15d后，抗病品種和感病品種的穗發(fā)病率分別為7.5％和89.1％，每穗病粒數(shù)分別為4.6和31.7。上述結果表明抗性品種穎殼表面分生孢子的萌發(fā)及菌絲從穎殼外表面侵入穎殼內側受到抑制，推遲了菌絲侵染花器的時間和侵染比例，減少了在水稻授粉前侵染穎花的幾率，導致穗發(fā)病率和病粒數(shù)顯著降低。
　　2.選用GFP熒光標記的稻曲菌分生孢子分別接種芽期、分蘗期、孕穗期和揚花期的水稻植株，觀察接種后的侵染過程，并利用GFP引

5、物檢測接種后不同生育期植株不同組織的帶菌率。研究結果表明:(1)芽期浸根接種后1-3d，稻曲菌分生孢子能附著在胚根和根毛的表面萌發(fā)形成菌絲，從根毛基部或側根生長點的細胞間隙侵入胚根表皮。接種5d后，菌絲在側根生長點和胚根表皮組織內大量繁殖擴展，并向上擴展至胚芽鞘。接種7d后，在芽鞘和不完全葉表面有少量菌絲定殖。在接種后30d（水稻生長至分蘗期）和接種后90d（水稻生長至孕穗期）的極少數(shù)稻株的葉鞘表面觀察到有綠色熒光菌絲的存在。用PCR方

6、法在接種后分蘗期至蠟熟期水稻植株的根、莖、葉以及孕穗期至蠟熟期的稻穗上均檢測到稻曲菌的存在。(2)分蘗期注射接種后1-7d，附著在葉鞘和莖表面的分生孢子萌發(fā)形成菌絲，并向四周擴展繁殖。但用PCR的方法，在孕穗期至蠟熟期的穗、葉和莖中均未檢測到稻曲菌的存在。(3)孕穗期噴霧接種后1-3d，分生孢予萌發(fā)形成的菌絲在劍葉的葉鞘表面擴展繁殖，形成菌絲團。接種后5-12d，在穎花穎殼上、雄蕊和雌蕊表面均未觀察到稻曲菌存在。但用PCR的方法在揚花期

7、和蠟熟期的穗和葉部檢測到稻曲菌的存在。而孕穗期注射接種后5-12d，菌絲能通過內外稃之間的縫隙侵入穎殼內表面，侵染花絲、花藥、柱頭和花柱，最終形成稻曲球，發(fā)病率為93.3％，平均每穗31.4個稻曲球。用PCR方法在揚花期和蠟熟期的穗、葉和莖部均檢測到稻曲菌的存在。用Real-time PCR方法檢測了孕穗期注射接種15d后三種灌漿相關基因（OsPromln2、OsRISBZ1和OsGlutln1）在穎花中的相對表達量，三種灌漿相關基因在

8、被侵染形成稻曲球的穎花中的相對表達量比被侵染未形成稻曲球的穎花分別上調13.2倍、43.5倍和28.6倍，表明灌漿基因的激活表達可能是稻曲球形成的關鍵因子。(4)揚花期噴霧接種后1-12d，分生孢子在穎殼外表面萌發(fā)形成的菌絲，菌絲擴展至穎殼內表面和子房基部，但未觀察到菌絲侵染花絲、花藥、柱頭、花柱和子房，而用PCR的方法在蠟熟期的穗部檢測到病原菌的存在。
　　上述研究結果表明:稻曲病菌分生孢子能夠在根、莖、葉、穎花等植物組織上萌發(fā)

9、產(chǎn)生菌絲，并向四周擴展繁殖，但不同接種方法觀察到菌絲擴展距離不一致。除分蘗期接種外，都可以用PCR方法在接種植株生育后期的不同組織檢測到稻曲菌存在。芽期接種后，稻曲菌侵染胚根，并可擴展到胚芽鞘、芽鞘、不完全葉乃至地上部的葉鞘。孕穗期注射接種后，觀察到稻曲菌從侵染到稻曲球形成的直接證據(jù)，表明稻曲球的形成與稻曲病菌能否在穎花受精之前完成對花柱和柱頭的侵染密切相關。一旦穎花受精完成，病原菌即使擴展至穎花內部，因無法吸收營養(yǎng)，也不能形成稻曲球，

10、稻曲菌不能引起揚花期穎花發(fā)病。
　　3.建立了高效的農(nóng)桿菌介導的稻曲病菌的轉化體系。該體系中稻曲菌孢子濃度為105個孢子/mL，共培養(yǎng)溫度為24℃，共培養(yǎng)時間為4d，AS濃度為200μmol/L，轉化子篩選的潮霉素濃度為200μg/mL，轉化效率為232.5個轉化子/105個孢子。通過該體系獲得了3016個具有穩(wěn)定潮霉素抗性的轉化子，篩選到5個產(chǎn)孢相關的突變體T-133、T-420、T-896、T-1296、T2328，采用Inv

11、erse-PCR和Tail-PCR的方法擴增并對T-DNA側翼序列進行了分析，結果表明突變體T-420和T-1296的T-DNA插入破壞的基因均與真菌中的假定蛋白有較低的同源性，其功能尚未見報道。突變體T-133的T-DNA插入破壞的基因與綠僵菌中的轉錄調控蛋白PRO1同源。突變體T-896的T-DNA插入破壞的基因與綠僵菌中絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶同源。突變體T-2328的T-DNA插入破壞的基因與鐮刀菌中多糖合成酶同源。
　　

12、4.對T-133突變體的產(chǎn)孢相關基因UvPRO1的功能進行了分析，結果表明，在PSA平板上生長6d后，敲除轉化子△UvPRO1-27的菌絲生長平均速度為2.20mm/d，顯著低于互補轉化子C△UvPRO1-27(2.76m m/d)和野生型菌株(2.73mm/d);在PS液體培養(yǎng)基中，野生型菌株和互補轉化子在培養(yǎng)7d后產(chǎn)生大量分生孢子，分生孢子量分別為6.72×106個/mL和6.82×106個/mL，而敲除轉化子△UvPRO1-27未

13、觀察到有分生孢子形成;在抗逆性方面，分別用不同濃度的NaCl(0.1-0.5mol/L)、SDS（0.01-0.05％）和CR（30-70μg/mL）測定了鹽脅迫壓力、細胞膜和細胞壁壓力對敲除轉化子的影響，結果表明敲除轉化子△UvPRO1-27在各種壓力條件下，均表現(xiàn)出比野生型菌株和互補轉化子更高的敏感性;孕穗期（幼穗分化7-8期）注射接種后1-3d，敲除轉化子△UvPRO1-27菌絲在水稻穎殼外表面延伸擴展。接種4d后，在穎殼外表面的