柑橘受黃龍病菌侵染后基因差異表達分析及抗病基因同源序列克隆.pdf

1、柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing，HLB）是全球柑橘產(chǎn)業(yè)最具毀滅性的病害之一。該病由韌皮部桿菌屬中的3種細菌，即亞洲韌皮部桿菌、非洲韌皮部桿菌和美洲韌皮部桿菌引起，我國的柑橘黃龍病病原則均為亞洲韌皮部桿菌（Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas）。近年來，國內(nèi)外對柑橘黃龍病進行了大量的病原檢測鑒定和遺傳變異性研究，但涉及黃龍病發(fā)生機理的研究很少。本文主要開展了不同抗性柑橘品種被黃

2、龍病菌侵染后體內(nèi)轉(zhuǎn)錄組變化的比較分析和抗病基因同源序列克隆的研究，目的是了解柑橘黃龍病抗性的分子機理，并為黃龍病抗病基因的利用奠定基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容和所得結(jié)果如下：
　　1.柑橘黃龍病毒源樹篩選。采用PCR方法對采自江西大余縣10棵疑似柑橘黃龍病病樹（臍橙）葉片進行了黃龍病菌、植原體和衰退病毒的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中兩棵樹（4號和5號）只含黃龍病菌，而不含植原體和衰退病毒。這兩棵樹被認為是理想的黃龍病毒源樹，并選擇4號毒源樹用作后續(xù)試

3、驗。
　　2.不同柑橘品種對HLB的室內(nèi)抗性鑒定。用獲得的HLB毒源樹對不同柑橘品種進行嫁接（芽接），之后用PCR方法定期（每月1次）檢測各品種的感染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在嫁接后3個月和4個月后分別從椪柑和琯溪蜜柚中檢測到CLas，而溫州蜜柑在嫁接8個月后仍然沒有檢測到CLas的存在。同時，在嫁接后8個月，椪柑和琯溪蜜柚各表現(xiàn)明顯和輕微的黃龍病癥狀，而溫州蜜柑仍無癥狀出現(xiàn)。表明椪柑高度感病，琯溪蜜柚次之，溫州蜜柑高度抗病。
　　

4、3.基因差異表達分析。采用基因芯片技術(shù)，對嫁接后4個月的椪柑和琯溪蜜柚植株葉片及其健康對照植株葉片進行基因差異表達分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，椪柑共有差異表達基因1106個，其中上調(diào)基因564個，下調(diào)基因542個；琯溪蜜柚共有差異表達基因910個，其中上調(diào)基因491個，下調(diào)基因419個。與韌皮部堵塞物質(zhì)相關(guān)的pp2基因在感染的椪柑和琯溪蜜柚中均呈上調(diào)表達；與半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteinase）合成相關(guān)基因在琯溪蜜柚中均為上調(diào)表達

5、，而在椪柑中存在不同程度的差異表達。許多代謝途徑如光合作用、糖類代謝、葉綠素、病程相關(guān)蛋白和GDSL脂肪酸等的基因在兩個柑橘品種中都存在著不同程度的差異表達。這些基因差異表達結(jié)果有助于闡明椪柑和琯溪蜜柚對黃龍病的抗病性差異。
　　4.抗病基因同源序列克隆。用抗病基因保守區(qū)域的簡并引物對3個柑橘品種的抗病基因同源序列（RGAs）進行克隆并對RGAs進行序列分析。結(jié)果共獲得26條RGAs，其中23條序列能夠翻譯成連續(xù)的氨基酸序列，其氨