小麥抗病基因同源序列分析及條銹菌誘導的防御酶活性研究.pdf

1、小麥條銹病是世界性的重要病害，嚴重威脅小麥生產(chǎn)。在我國，特別是西南麥區(qū)由于適宜的發(fā)病條件和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)造成的栽培品種和遺傳背景的單一化，使得條銹病成為我國小麥生產(chǎn)上最為嚴重的病害，造成巨大的經(jīng)濟損失。本研究以小麥新品種川農(nóng)17(R57)、川農(nóng)19(R88)、及其它抗病品種(系)為材料，以條銹菌水源14、條中32和流行生理小種混合菌為誘導菌種，采用生化分析方法，RGA分析技術(shù)，借助生物信息學分析手段，研究病原菌誘導后抗病相關(guān)防御酶系活性的變化

2、規(guī)律；并對小麥抗病相關(guān)的基因片段進行分離、克隆，探討這些特異性片段結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；同時對四川省普遍使用的小麥抗病遺傳材料的抗病基因同源序列多樣性進行分析，為進一步闡明小麥抗病生化和分子機制，抗條銹病基因的分離、克隆，合理選擇小麥抗性親本提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： 1病原菌誘導后抗、感小麥品種可溶性蛋白及防御酶系活性變化分析表明： 1)條銹菌水源14、條中32分別接種后，抗、感品種的可溶性蛋白含量在48h后出現(xiàn)高峰

3、，而混合菌種接種后可溶性蛋白含量高峰均推后到72小時。2)抗病品種的SOD活性在接種(單、混合菌種)后在0-24h內(nèi)均出現(xiàn)上升趨勢，感病品種的SOD活性在該時間段均出現(xiàn)不同程度的降低趨勢。3)抗病品種的POD活性在接種(單、混合菌種)后0-96h內(nèi)總體上呈上升趨勢，其最終活性均高于感病品種，而感病品種的POD變化呈現(xiàn)兩個峰值；混合菌系接種后POD活性的變化較單菌接種顯著。4)抗病品種的CAT活性在接種后0-24h迅速降低，此后略有回升，

4、R88CAT活性總體上高于R57；感病品種在整個過程中CAT活性變化不明顯；接種單菌系與混合菌系CAT活性變化無明顯差異。 2利用RT-PCR技術(shù)對小麥抗性材料進行擴增，共有78對RGA引物組合擴增出清晰可辨譜帶，通過1.5％的瓊脂糖電泳共檢測出142條較強的條帶，平均每對引物擴增出1.82條。其中，引物Xal-NBS-F/Xal-NBS-R在R88品種(接種誘導48h)中擴增出一條特異性條帶RGA702；引物XalLR-F/X

5、alLR-R在10N材料中(接種誘導24h和72h)均擴增出另一條特異性條帶RGA200。序列分析表明：1)RGA702編碼的氨基酸序列與玉米、黑麥草及水稻的蛋白磷酸酯酶2A相似達95％以上，該序列編碼的產(chǎn)物可能參與植物抗病代謝過程。2)RGA200編碼的氨基酸序列與大麥、水稻、玉米的酰基轉(zhuǎn)移蛋白具有較高的相似性(＞76％)，但該序列含多個終止密碼子，推測其可能是一個假基因。 3根據(jù)小麥抗條銹病基因的NBS區(qū)域的保守結(jié)構(gòu)設(shè)計兩對

6、引物，其中一對引物Z1/Y2在小麥品種R88和4個黑麥材料的基因組中分別擴增出2條長度為344bp(R88)和341bp(黑麥)的特異性條帶。對其中的2個克隆RGAR88-1(R88)與RGARA-2(黑麥)序列比對分析，兩者核苷酸序列相似性高達94.7％，編碼的蛋白均具有NBS-LRR保守結(jié)構(gòu)，各含一個開放閱讀框，與禾本科其它屬種的蛋白激酶、抗性蛋白復合體等具有較高的相似性，可能屬于NBS-LRR抗病基因家族。這兩條序列的GenBan

7、k登錄號為DQ494534和DQ494535。此結(jié)果表明，小麥新品種川農(nóng)19(R88)的高抗條銹病特性可能與黑麥特性片段插入有關(guān)，為其抗性的來源提供了初步的分子證據(jù)。 4通過RGAP方法對四川省主要利用的82份小麥抗病遺傳材料進行了分析，篩選出多態(tài)性高的三對RGA引物組合：Ptokin1IN/Ptokin2IN、Cer31/XLRRINV2、AS3/S2，共獲得123條帶，其中54條帶具有多態(tài)性，多態(tài)率達43.9％。UPGMA分