受水稻紋枯病菌誘導表達OsWRKY基因的克隆及初步分析.pdf

1、水稻紋枯病是水稻三大病害之一，近年來紋枯病危害面積迅速擴大，危害程度急劇加重，已嚴重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此對水稻紋枯病的防治已迫在眉睫。由于引起水稻紋枯病的立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kühn)具有強腐生性和寬寄主范圍，利用傳統(tǒng)方法很難找到較高水平的抗源，給水稻紋枯病的抗性研究帶來一定的困難，因而目前國內(nèi)外還未深入展開紋枯病的抗病機制和遺傳育種研究。 探討轉(zhuǎn)錄因子在植物防御系統(tǒng)中的功能成為近年來的研究熱

2、點之一。在植物中發(fā)現(xiàn)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子超家族是因其家族成員N-末端都含有WRKYGQK七個保守的氨基酸而得名。所有已知的WRKY家族成員均含有一個或兩個WR_KY結(jié)構(gòu)域及一個Cys<,2>His<,2>或Cys2I-IisCys類型的鋅指結(jié)構(gòu)基序。目前很多研究表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與調(diào)控植物的生長發(fā)育、新陳代謝及對生物或非生物脅迫的應答反應。 本論文在水稻紋枯病菌侵染12小時的水稻組織中克隆出OsWRKY74基因的cDNA，

3、繼而對OSWRKY74基因的表達譜進行初步的分析，為進一步研究OsWRKY74基因在水稻抗紋枯病防御反應中的作用打下基礎。 本研究首先對紋枯病的抗性鑒定方法進行了改良。利用文獻報道的3種抗性鑒定方法接種水稻，發(fā)病率不高，病情也輕重不一。而采用本實驗室改進的抗病鑒定方法一菌條法接種水稻葉鞘可達到100﹪發(fā)病率，而且病情比較均一，重復性高，能滿足實驗室的抗病鑒定需要。然后以水稻品種日本晴為材料，用水稻紋枯病菌強致病菌株AG-1-IA

4、進行接種，12小時后取樣提取總RNA。根據(jù)已知WRKY基因家族的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域設計兩條簡并引物Pwrkyl和Pwrky2，通過3’RACE的方法獲得4個特異性片段，其中Pwrkyl引物擴增的片段大小分別為257bp和382bp，Pwrky2引物擴增的片段大小分別為485bp和696bp。通過在Genebank中進行序列比對分析，發(fā)現(xiàn)257bp片段與水稻OsWRKY174基因序列有96﹪以上同源性；而其它片段則可能是由于引物錯配得到的非目的

5、片段。為進一步研究克隆所得到的WRKY基因的功能，用Noghem blot技術對OsWRKY74基因進行了表達譜分析。結(jié)果顯示OsWRKY74基因在受紋枯病菌接種誘導后12h、24h、36h、60h存在差異表達，12h時表達量最高，24h、36h以及60h時表達量已經(jīng)顯著下降至本底水平。生物信息學分析結(jié)果顯示，OsWRKY74蛋白是由361個氨基酸組成，含有一個WRKY結(jié)構(gòu)域，一個核定位信號，兩個SUMO結(jié)構(gòu)域及Cys2His2模式的鋅