水稻紋枯病菌遺傳多樣性及侵染水稻早期上調(diào)表達(dá)基因的分析.pdf

1、稻紋枯病嚴(yán)重制約水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，已成為水稻上的首要病害。本論文以分離自我國(guó)湖北省、江西省、湖南省、江蘇省、廣西省等省份的紋枯病菌菌株為材料，研究了其遺傳多樣性；并以分離自武漢水稻田中的WH-1菌株為材料，分離獲得了紋枯菌在侵染水稻早期上調(diào)表達(dá)的基因。主要結(jié)果如下： 自水稻葉鞘發(fā)病部位及紋枯病菌核共分離獲得1088株菌株，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等鑒定方法，確認(rèn)98.2％的菌株為茄絲核菌AG-1IA(Rhizoctoniasola

2、niAG-1IA)，另外有19株菌株為稻角擔(dān)菌(Ceratobasidumoryzae-sativae)，1株菌株為茄絲核菌AG-7，表明引發(fā)水稻紋枯病的病菌主要為茄絲核菌AG-1融合群中的IA亞群，有性態(tài)為擔(dān)子菌門瓜亡革菌(Thanatephoruscucumeris)。對(duì)來(lái)自同一田塊或來(lái)自不同省份的菌株進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谏L(zhǎng)、菌絲直徑、菌落形態(tài)和致病力等方面存在豐富的多樣性。隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性分析(RAPD)表明來(lái)自同一水稻田塊

3、的菌株間出現(xiàn)豐富的遺傳分化現(xiàn)象，在0.83相似水平上，可以歸于16個(gè)亞組；RAPD分析也表明來(lái)不同省份的71個(gè)菌株可以分為15個(gè)亞組，且與菌株來(lái)源沒(méi)有顯著關(guān)系。自廣西桂林和湖北武漢的稻田中分別獲得3株和1株表型特異的菌株，它們?cè)谏L(zhǎng)、菌落形態(tài)和致病等方面與正常菌株均有顯著性差異。 對(duì)分離自廣西桂林的菌株GXE4進(jìn)行了詳細(xì)的研究。與正常菌株相比，菌株GXE4菌落顏色深，呈黃褐色，菌絲生長(zhǎng)速率慢，產(chǎn)菌核數(shù)量少且不易產(chǎn)生菌核，對(duì)水稻沒(méi)

4、有致病力。采用真菌rDNA基因ITS區(qū)域序列、核型觀察、菌絲融合試驗(yàn)，證實(shí)菌株GXE4是茄絲核菌AG-1融合群IA亞群。菌株GXE4中存在一條獨(dú)立于染色體和線粒體DNA外的DNA片段，大小約3.6kb，命名為3.6-kbfrags。3.6-kbflags可以穩(wěn)定的存在于菌株內(nèi)，不能被抗生素、原生質(zhì)體再生、SDS和溴化乙錠等操作消除掉。DNaseI、RNase、限制性內(nèi)切酶、外切酶Ⅲ等降解試驗(yàn)表明3.6-kbfrags具雙鏈DNA特性，且

5、3’端不含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)或蛋白質(zhì)保護(hù)性結(jié)構(gòu)。對(duì)3.6-kbflags進(jìn)行了克隆和序列分析，發(fā)現(xiàn)在3.6-kbfrags至少包含有兩個(gè)大小類似、序列具有同源性的遺傳因子，分別命名為3.6-kbflag-1和3.6-kbflag-2；3.6-kbflag-1沒(méi)有氨基酸數(shù)超過(guò)110的閱讀框，推定不具有編碼功能；不完全序列分析表明3.6-kbfrag-2也沒(méi)有較大的閱讀框。DNA雜交結(jié)果顯示位于約23kb和7.0kb處還存在與3.6-kbflags

6、具明顯雜交信號(hào)的DNA片段。根據(jù)這些研究結(jié)果初步推定3.6-kbflags可能是dsDNA病毒基因組的缺陷型DNA，或線性真菌質(zhì)粒。 菌株RCOL-1分離自湖北武漢華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田。菌株RCOL-1對(duì)水稻沒(méi)有致病力，它與雙核菌稻角擔(dān)菌(C.oryzae-sativa)在生長(zhǎng)、菌落形態(tài)、菌核大小等表型上非常相似，與茄絲核菌AG-1融合群的菌株則有顯著的差異。DAPI熒光染色核型分析表明，菌株RCOL-1的細(xì)胞核型沒(méi)有規(guī)律，約95

7、.9％為雙核，2.8％為多核，1.3％為單核。通過(guò)特異性引物PCR擴(kuò)增及DNA雜交證實(shí)RCOL-1中含有C。oryzae-sativae和T.cucumeris兩種真菌的rDNA；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該菌株中存在4種類型的核糖體RNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS，internaltranscribedspace)，其中大部分的ITS序列與C.oryzae-sativae的相同，少部分的ITS與T.cucumeris相同；另有2種ITS是這兩種真菌I

8、TS的嵌合物，即ITS1與C.oryzae-sativae的ITS1相同，ITS2與T.cucumeris的ITS2相同，或ITS1與T.cucumeris的ITS1相同，ITS2與C。oryzae-sativae的ITS2相同。推定RCOL-1中存在4種類型的ITS是T.cucumeris中的rRNA基因向C.oryzae-sativae水平轉(zhuǎn)移的結(jié)果。 以水稻紋枯病菌菌株WH-1和水稻9311為材料，采用抑制差減雜交(sup

9、pressionsubtractivehybridization,SSH)的方法，篩選獲得了129個(gè)病菌侵染水稻初期(12hpi)表達(dá)量明顯增強(qiáng)的EST克隆。對(duì)表達(dá)量明顯增強(qiáng)的克隆進(jìn)行序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)96個(gè)克隆的序列與Genbank的序列具有一定程度的相似性，33個(gè)序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有相似性序列存在。對(duì)克隆了進(jìn)行MIPS基因功能分類分析，推定這些上調(diào)表達(dá)基因的功能廣泛，涉及到代謝(13％)、蛋白命運(yùn)(9％)、信號(hào)傳導(dǎo)(5％)、細(xì)胞防御(