煙草受激素誘導和逆境脅迫相關基因的克隆與表達分析.pdf

1、煙草(Nicotiana tabacum)是轉基因的模式植物，也是我國重要的經濟作物，每年為國家經濟發(fā)展做出重要貢獻，但煙草生產上因受逆境脅迫和病蟲危害每年損失很大。分離鑒定煙草受非生物脅迫如激素和環(huán)境脅迫誘導的功能基因，對揭示其抗逆分子機制和煙草抗逆遺傳改良有重要意義。本實驗室通過激素、低溫和干旱脅迫已分離獲得三個相關轉錄因子和一些抗逆脅迫功能基因，本文在此基礎上研究這些基因的全長序列和表達特征，結果如下：
　　 1．AP2/

2、ERF類轉錄因子是植物中特有的一類轉錄因子，結構上具有相似的特征，在調控乙烯應答以及抗病相關基因的表達中起重要作用。本研究通過454測序分離得到了一個煙草AP2/ERF轉錄因子類基因，通過RACE方法克隆獲得了該基因的全長cDNA序列，從煙草基因組擴增獲得了其DNA序列，分析了該基因的結構，發(fā)現(xiàn)其含有2個內含子，3個外顯子。對該基因進行了初步生物信息學分析。同源性分析表明NtAP2/ER目的DNA結合域是相當保守的，進化上屬于AP2/E

3、RF家族轉錄因子。半定量RT—PCR發(fā)現(xiàn)NtAP2/ERF在煙草各器官中的表達量差異不大，但在不同處理誘導后的表達模式不一樣，受乙烯和干旱誘導表達量較大，說明煙草AP2/ERF可能還參與乙烯應答以外的脅迫信號反應。
　　 2．通過基因芯片雜交結果分離得到了一個煙草CDI(Cyclin—dependent kinaseinhibitor)類基因，利用RACE方法克隆獲得了該基因的全長，命名為NtCDI1，該基因核苷酸長度為：905

4、 bp，編碼蛋白長度為：211 aa，同時從煙草基因組擴增該基因，獲得了它的DNA序列，長度為：1405 bp，分析該基因結構，發(fā)現(xiàn)其含有3個內含子。另外對該基因的相關生物信息學進行了初步分析，如分子量、等電點、疏水性、同源性、細胞定位，同源性分析表明該基因的CDI結構域是相當保守的。半定量RT—PCR對該基因的組織器官特異性和不同處理誘導后的表達模式進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)該基因在煙草不同器官中和不同處理誘導后的表達量不一樣。
　　

5、3．通過煙草454測序分離獲得了一個含basic helix—loop—helix(bHLH)結構的基因，根據已知的EST序列設計引物，利用RACE技術克隆了其5’端和3’端未知序列。該基因編碼243個氨基酸，具有bHLH結構域和LCD1結構域，同源性分析表明，該基因bHLH結構域在進化過程中是相當保守的。從全長cDNA兩頭設計引物，PCR擴增煙草cDNA和煙草基因組，獲得了該基因不同拷貝的cDNA序列和DNA序列，分析該基因結構，發(fā)現(xiàn)

6、其有5個外顯子。半定量RT—PCR分析表明，該基因在煙草根中的表達量最大，莖、葉、花、果中表達量??；水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)、乙烯利處理和干旱脅迫下該基因表達量增大，低溫脅迫下該基因表達量降低。
　　 4．通過RACE方法克隆了一個煙草Germin—like基因的全長cDNA序列，核苷酸長度為925 bp，開放閱讀框長687 bp，共編碼228個氨基酸，具有一個cupin結構域?；蚪M擴增和結構分析表明，該基因含有2個外

7、顯子和一個內含子。通過生物信息學初步揭示了該基因的分子量、等電點、疏水性、細胞定位、空間結構和同源性。半定量RT—PCR分析表明該基因主要在煙草根中表達，水楊酸、乙烯利、低溫和干旱處理都能使該基因的表達量增大，脫落酸對該基因的表達量影響不大。構建了該基因的病毒誘導沉默載體，為研究該基因的功能提供了條件。
　　 5．通過煙草454測序分離得到了一個LEA基因片段，利用半定量RT—PCR和基因芯片分析了該基因的時空表達特征和受多種激