棉花防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因類似物的克隆與特征分析和受黃萎病誘導(dǎo)表達(dá)的兩個(gè)全長(zhǎng)cDNA的獲得.pdf

1、植物在自然界中受到許多病原物的威脅，如病毒、細(xì)菌、真菌、線蟲等。棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，棉纖維是主要的紡織原料。而棉花的病害比較多，我國(guó)枯萎病、黃萎病尤其嚴(yán)重，給棉花生產(chǎn)造成很大的損失．實(shí)踐證明，種植抗病品種是防治病害的最經(jīng)濟(jì)有效的方法。陸地棉是我國(guó)棉花的主栽品種，陸地棉抗枯萎病育種非常成功，但黃萎病抗病品種的培育一直是育種家的一大難題，主要原因在陸地棉中找不到免疫或高抗的黃萎病抗源。根據(jù)其他作物中克隆的抗病基因與防衛(wèi)反應(yīng)基因的信息，分離

2、鑒定棉花抗病基因類似物(resistance gene analogs，RGAs)與防衛(wèi)基因類似物(defense gene analogs，DGAs)，有助于直接克隆或開發(fā)與棉花抗病基因緊密連鎖的標(biāo)記，定位、克隆抗病基因，為培育抗病品種奠定基礎(chǔ)。 本研究選用我國(guó)遺傳研究和育種廣泛利用的抗黃萎病品種海島棉海7124(G.brbadense L.cv.Hai7124)為材料來(lái)克隆抗病基因類似物(RGAs)和防衛(wèi)基因類似物(DGAs

3、)。成功分離了79條核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Nucleotide bindingsite，NBS)類RGAs，21條絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶(Serine／Threonine kinase，STK)類RGAs和11條DGAs。棉花中已經(jīng)報(bào)道的NBS類RGAs有143條，我們分離的79條NBS類RGAs中1 3條與已克隆的棉花RGAs沒有序列相關(guān)性，其它66條序列與已克隆的棉花RGAs有85％～99％的序列同源性．將本研究分離的79條NBS類RGA

4、s與先前克隆的143條RGAs進(jìn)行聚類分析，所有這些NBS類RGAs可以分為十個(gè)亞類(I-X)，其中亞類IX的所有成員由本研究克隆的5條序列組成。與其它雙子葉作物中得到的結(jié)果類似，我們分離的具有連續(xù)開放讀框的NBS類RGAs依其氨基酸序列可以分為兩類，具有Toll-白介素-l受體(To11-Interleukin-1 receptor，TIR)與不具有該結(jié)構(gòu)的non-TIR。這兩類RGAs都存在NBS類RGAs保守的六個(gè)基元：P-1oo

5、p、RNBS-A、Kin-2、RNBS-B、RNBS-C、GLPL。鑒定了棉花TIR與non-TIR各自所特有的RNBS-A序列。為棉花R基因和NBS類RGAs的分類提供依據(jù)。對(duì)STK類RGAs進(jìn)行BLASTx發(fā)現(xiàn)與雙子葉作物的激酶類蛋白具有高的同源性。將具有連續(xù)ORF的20條sTK類RGAs翻譯成氨基酸，按序列相似性可分為兩類，每類含有10條序列。另外將這20條氨基酸序列與已克隆的番茄的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶與水稻的受體類似蛋白激酶進(jìn)行

6、多序列比對(duì)。鑒定了I-VII七個(gè)STK類抗病基因的保守基元。分離的11條DGAs與GenBank中的病程相關(guān)蛋白具有較高的同源性。4條DGAs具有連續(xù)的ORF，它們的翻譯產(chǎn)物與柑橘和三葉膠的β-1，3-葡聚糖酶之間表現(xiàn)出很高的同源性。植物功能相關(guān)但序列高度歧化的抗性基因或其類似物常成簇排列在植物基因組上。隨機(jī)調(diào)取4條TIR-NBS與4條non-TIR-NBS類RGAs，Southern雜交顯示3條non-TIR-NBS類RGAs具有相同

7、的帶型，可能這些序列在基因組上成簇分布。在被分析的8條序列中，5條有5個(gè)以上的家族成員．這可能是由于在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過程中，抗性位點(diǎn)必須保持多樣化以適應(yīng)病原物的多變性。為了鑒定與抗黃萎病相關(guān)的RGAs，用具有連續(xù)ORF的48條NBS類與20條sTK類RGAs，4條DGAs設(shè)計(jì)特異引物，以接茵黃萎病菌后棉花根為材料對(duì)這些RGAs進(jìn)行RT-PCR分析。發(fā)現(xiàn)有6條NBS類與1條STK類RGAs受黃萎病誘導(dǎo)表達(dá)，1條DGAs接菌黃萎病后上調(diào)表達(dá)

8、?？共』蝾愃莆锒鄳B(tài)性(Resistance gene analogs polymorphism，RGAP)與(Defense gene analogs polymorphism，DGAP)標(biāo)記常和抗性位點(diǎn)相連鎖。我們用克隆的RGAs與DGAs設(shè)計(jì)特異引物，以開發(fā)RGAP與DGAP，并將7個(gè)標(biāo)記定位于棉花染色體上。利用受黃萎病上調(diào)表達(dá)的一條DGA和黃萎病誘導(dǎo)表達(dá)的一條STK類RGA，設(shè)計(jì)RACE引物，成功克隆了這兩個(gè)基因的cDNA全長(zhǎng)，

9、分別與β-1，3-葡聚糖酶與受體類似蛋白激酶高度同源，命名為CbCLU和GbRLK。對(duì)這兩個(gè)基因編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，它們分別含有糖基水解酶和激酶的保守結(jié)構(gòu)域。Southern雜交顯示，GbGLU在基因組里可能有一個(gè)拷貝，而GbRLK有兩到三個(gè)拷貝。通過Northern對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與RT-PCR結(jié)果相吻合，GbGLU在黃萎病誘導(dǎo)后24h有微量表達(dá)，到96h表達(dá)量最強(qiáng)；GbRLK只在接菌黃萎病后96h表達(dá)，其它時(shí)期不表達(dá)