優(yōu)雅蟈螽海藻糖代謝相關(guān)基因cDNA全長(zhǎng)克隆及表達(dá)分析.pdf

1、海藻糖是由兩個(gè)D-吡喃葡萄糖以α1-α1糖苷鍵連接形成的非還原性二糖，在高溫、寒冷、缺氧、干燥、脫水和營(yíng)養(yǎng)匱乏等惡劣環(huán)境脅迫下，昆蟲體內(nèi)海藻糖能有效地穩(wěn)定脫水酶，保護(hù)細(xì)胞膜和蛋白。本研究為海藻糖在提高昆蟲抗逆性方面的研究提供理論基礎(chǔ)。
　　基于高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選，從優(yōu)雅蟈螽中克隆TPS和Tre基因cDNA全長(zhǎng)。旨在研究模擬野外溫度驟變和緩慢升降溫馴化對(duì)優(yōu)雅蟈螽 Gampsocleis gratiosa海藻糖合成酶（TPS）基因表

2、達(dá)量、血淋巴海藻糖和總糖含量的影響和三者間的相關(guān)性，以及海藻糖水解酶（Tre）基因組織特異性表達(dá)。采取模擬野外溫度驟變和緩慢升降溫兩種溫度馴化策略，以熱電偶溫度計(jì)測(cè)得優(yōu)雅蟈螽體溫與環(huán)境溫度最為接近的溫度值作為最適溫度，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定優(yōu)雅蟈螽TPS不同溫度表達(dá)和Tre表達(dá)的組織特異性，硫酸蒽酮法測(cè)定血淋巴海藻糖和總糖含量（以25℃最適溫度作為對(duì)照）。
　　克隆得到一個(gè)TPS基因，一個(gè)水溶性海藻糖水解酶（Tre1）基因和一個(gè)類

3、膜結(jié)合型海藻糖水解酶（Tre2-like）基因。TPS基因命名為GgTPS（GenBank登錄號(hào)：KU578006），全長(zhǎng)3225 bp，包含2430 bp的開放閱讀框，5′-非編碼區(qū)（5′-UTR）153 bp和3′-非編碼區(qū)（3′-UTR）642 bp。共編碼809個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的蛋白分子量（Mw）91.35 ku，理論等電點(diǎn)（pI）6.28。兩個(gè)Tre基因分別命名為GgTre1，GgTre2-like。分離到3個(gè)不同的GgTre1

4、轉(zhuǎn)錄本（GenBank登錄號(hào)：KY400001~KY400003），全長(zhǎng)分別為2107，2021，1914 bp，5'-UTR33 bp，3'-UTR長(zhǎng)度分別為322，248，129 bp。轉(zhuǎn)錄本1和轉(zhuǎn)錄本3編碼區(qū)長(zhǎng)度為1752 bp，編碼583個(gè)氨基酸。蛋白分子量和等電點(diǎn)分別為67.88 ku和6.59。轉(zhuǎn)錄本2編碼區(qū)長(zhǎng)度1740 bp，編碼579個(gè)氨基酸，蛋白分子量和等電點(diǎn)分別為67.29 ku和6.34。得到3個(gè)不同的GgTre2

5、-like轉(zhuǎn)錄本亞型（ GenBank登錄號(hào)：KY400004~KY400006），全長(zhǎng)分別為2491，2460，2381 bp，5'-UTR284 bp，3'-UTR分別為398，367，285 bp。開放閱讀框1809 bp，編碼602氨基酸，蛋白分子量和等電點(diǎn)分別為67.88 ku和6.59。
　　驟然降溫階段 TPS相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在15℃最高，與最適溫度25℃差異顯著。海藻糖相對(duì)含量在0℃顯著高于25

6、℃?？偺窍鄬?duì)含量在0℃和10℃顯著高于25℃。驟然升溫階段，TPS相對(duì)表達(dá)量呈先降低后升高，再降低的變化趨勢(shì)，40℃達(dá)到最高且與25℃差異顯著。緩慢降溫階段 TPS相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在15℃和20℃顯著高于25℃；海藻糖含量表現(xiàn)出先降低后升高的變化趨勢(shì)，0℃顯著高于25℃，總糖含量在0℃、10℃和20℃與25℃差異顯著。緩慢升溫階段TPS相對(duì)表達(dá)量呈先降低后升高的變化趨勢(shì)，但與25℃無顯著差異。海藻糖相對(duì)含量在40℃顯

7、著低于25℃?？偺窍鄬?duì)含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，40℃和45℃顯著高于25℃。不同溫度馴化策略比較TPS相對(duì)表達(dá)量在15℃、40℃差異顯著。海藻糖相對(duì)含量在40℃和45℃差異顯著?？偺窍鄬?duì)含量在10℃和20℃差異顯著。體溫在30℃差異顯著。GgTre1在雌性卵巢和雄性附腺表達(dá)量最高。GgTre2-like在卵巢中高表達(dá)，在雄性肌肉和馬氏管高表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫度馴化能夠提高昆蟲的抗逆能力，昆蟲體內(nèi)TPS表達(dá)量和海藻糖合