花背蟾蜍蝌蚪晶狀體的再生及相關(guān)Pax-6基因全長cDNA克隆和表達(dá)分析.pdf

1、以無尾兩棲類(Anuran)花背蟾蜍(Bufo Raddei Strauch)后肢芽期蝌蚪為實(shí)驗(yàn)材料，摘除其左眼晶狀體，在再生不同時(shí)期固定，石蠟連續(xù)切片，蘇木精-伊紅對染，光鏡觀察，研究晶狀體再生的組織來源；另外，選再生不同時(shí)期材料用戊二醛，鋨酸固定，透射電鏡觀察，以研究晶狀體再生組織的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明：花背蟾蜍蝌蚪(1)具有晶狀體再生的能力，其晶狀體的再生來源于虹膜背緣的上皮細(xì)胞；(2)虹膜背緣去色素是轉(zhuǎn)分化的前提，主要有兩種方

2、式：一種也是最主要的方式是在晶狀體被摘除后虹膜外側(cè)產(chǎn)生巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬虹膜色素上皮細(xì)胞中的色素顆粒；另一種方式是虹膜色素上皮細(xì)胞自身釋放色素顆粒；(3)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)虹膜色素上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中線粒體有明顯變化，核糖體增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，晶狀體纖維分化過程中細(xì)胞核逐漸凝聚。 Pax6基因又稱為同源異形框(盒)基因(homeobox genes，Hox)其表達(dá)方式高度保守，在脊椎動物中Pax-6基因在眼組織中的表達(dá)對眼的結(jié)構(gòu)

3、發(fā)育和細(xì)胞的分化是必需的。選擇花背蟾蜍18期的蝌蚪胚胎作為實(shí)驗(yàn)材料，設(shè)計(jì)兼并引物克隆新物種基因；使用由5'及3'RACE得到的序列信息設(shè)計(jì)新的引物，采用RACE(RapidAmpliphicationof cDNA Ends)的方法以及RNaseH-的逆轉(zhuǎn)錄酶和高保真的熱穩(wěn)定聚合酶對序列進(jìn)行擴(kuò)增，成功的得到了花被蟾蜍Pax6基因的全長cDNA克隆。對該全長基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括載體序列的去除，基因開放閱讀框(Open Readin

4、g Frame，ORF)的預(yù)測，基因編碼蛋白序列翻譯，與其他物種同源性的比對。發(fā)現(xiàn)花背蟾蜍Pax-6基因與非洲爪蟾和人類該基因的同源性分別高達(dá)85％和84％，在其他的物種中也有相當(dāng)高的同源性。這是一個(gè)在進(jìn)化上相當(dāng)保守的基因，說明了該基因在眼睛和晶狀體發(fā)育過程中的重要作用和在進(jìn)化過程中的重要地位。 實(shí)驗(yàn)條件下建立胚胎晶狀體發(fā)育的時(shí)期梯度模型和晶狀體再生的時(shí)期梯度模型，采用熒光定量PCR (Real-Time PCR)技術(shù)，對胚胎晶

5、狀體發(fā)育不同時(shí)期和晶狀體摘除后再生不同時(shí)期Pax-6基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了實(shí)時(shí)監(jiān)控，并對該基因的表達(dá)模板量進(jìn)行了相對定量分析，得到了在花背蟾蜍晶狀體發(fā)育和再生過程中該基因表達(dá)量的一系列變化，結(jié)果表明：(1)在胚胎發(fā)育的時(shí)期梯度模型中顯示了兩個(gè)表達(dá)量的峰值，從12到19期形成一個(gè)明顯的以神經(jīng)管期(16期)為最高的表達(dá)趨勢，而在鰓血循環(huán)期(20期)又出現(xiàn)了一個(gè)新的表達(dá)高峰。(2)熒光定量PCR結(jié)果顯示在花背蟾蜍的晶狀體再生的第7天Pax-

6、6基因的表達(dá)量達(dá)到最高，表明此時(shí)期Pax-6基因在晶狀體再生的過程中起到調(diào)控細(xì)胞增殖的作用。晶狀體再生的第30天晶狀體纖維開始分化，熒光定量的結(jié)果顯示再生30天比21天Pax6基因的表達(dá)量高，表明在此時(shí)期Pax-6基因?qū)υ偕倪^程中調(diào)控晶狀體纖維分化方面起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用。初步驗(yàn)證了該基因在花背蟾蜍晶狀體發(fā)育和再生過程中是發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞增殖和晶狀體纖維的分化的作用。以上的研究結(jié)果為深入探討Pax-6基因和相關(guān)蛋白在晶狀體再生修復(fù)過程中的