豬鏈球菌2型超氧化物歧化酶SodA與絲氨酸-蘇氨酸去磷酸酶Stp1影響細(xì)菌毒力研究.pdf

1、豬鏈球菌2型（Streptococcus suis serotype2，SS2），是一種重要的人獸共患病病原。感染豬臨床表現(xiàn)為腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥等病癥，且能感染人，引發(fā)心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血性休克等疾病，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡。1998年和2005年，我國江蘇和四川分別發(fā)生了人的豬鏈球菌2型感染，給公共衛(wèi)生帶來重大威脅。豬鏈球菌2型致病與細(xì)菌黏附、侵襲呼吸道上皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞，抗吞噬細(xì)胞的吞噬及激活免疫細(xì)胞炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)。研究顯示，

2、豬鏈球菌表面蛋白能夠與人血清中的補(bǔ)體負(fù)調(diào)節(jié)因子相結(jié)合，以逃避人體免疫細(xì)胞的吞噬，從而增強(qiáng)其在血液中的存活能力;豬鏈球菌2型抗巨噬細(xì)胞吞噬的成分有莢膜多糖、肽聚糖脫乙酰酶蛋白、超氧化物歧化酶等。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶Superoxide dismutase-SodA是豬鏈球菌2型的重要毒力因子，可清除超氧根離子，增強(qiáng)細(xì)菌抗氧化應(yīng)激的作用。新發(fā)現(xiàn)原核生物的絲氨酸/蘇氨酸激酶和磷酸酶與其對(duì)環(huán)境抗性、對(duì)毒力因子表達(dá)調(diào)控和對(duì)宿主的致

3、病性緊密相關(guān)。
　　本研究目的:(1)初步解析sodA缺失提高豬鏈球菌2型黏附細(xì)胞的機(jī)制;(2)探明豬鏈球菌2型SodA減輕細(xì)胞自噬的機(jī)制;(3)以小鼠為模型初步探明絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶Stp1在豬鏈球菌2型致病中的作用。
　　1.豬鏈球菌2型SodA介導(dǎo)對(duì)細(xì)胞的黏附，減輕小鼠巨噬細(xì)胞自噬
　　sodA基因缺失株對(duì)細(xì)胞黏附率顯著地高于親本株:△sodA株對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附率為22.6‰，而親本株為0.3‰(p＜0.01

4、);△sodA株對(duì)HEp-2細(xì)胞黏附率為21.3‰，而親本株為0.4‰(p＜0.01)。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，sodA缺失株被吞噬率顯著地高于親本株(15.71％ vs0.67％, p＜0.01)。為探究sodA基因缺失對(duì)細(xì)胞黏附提高的機(jī)制，對(duì)豬鏈球菌2型細(xì)菌野生株和sodA缺失株進(jìn)行了細(xì)菌表面蛋白的二維電泳分離，選擇了6個(gè)表達(dá)差異較大的點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定及對(duì)相應(yīng)蛋白mRNA熒光定量分析，結(jié)果顯示sodA缺失株硫氧還蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄

5、水平顯著高于親本株。為探究其機(jī)制，原核表達(dá)了豬鏈球菌的硫氧還蛋白Thioredoxin-1和Thioredoxin-2，并制備了相應(yīng)的兔源多抗。通過提取細(xì)菌表面蛋白進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)sodA基因缺失對(duì)Thioredoxin-1表達(dá)影響不顯著，而Thioredoxin-2表達(dá)顯著上升，故推測(cè)Thioredoxin-2可能介導(dǎo)了sodA缺失株的黏附上升。
　　前期研究表明，豬鏈球菌2型sodA缺失株在巨噬細(xì)胞中抗吞噬和殺菌能力顯著下降，提

6、示SodA可能通過降低ROS對(duì)菌體的損傷，有利于其存活。為探究SodA對(duì)豬鏈球菌2型感染小鼠巨噬細(xì)胞自噬的影響及其機(jī)制，以感染比(MOI)100∶1，將豬鏈球菌2型野生型(WT)與sodA缺失株(△sodA)感染穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的RAW264.7細(xì)胞。激光共聚焦分析顯示△sodA感染的細(xì)胞中LC3-Ⅱ-GFP熒光斑點(diǎn)數(shù)顯著高于野生型菌株(p＜0.01);用溶酶體標(biāo)記分子Lysortrack進(jìn)行跟蹤，溶酶體與LC3-Ⅱ-GFP分子的

7、共定位;免疫印跡檢測(cè)自噬標(biāo)記分子LC3-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)差異，灰度比結(jié)果顯示△sodA相對(duì)親本株更早促進(jìn)細(xì)胞自噬;△sodA株在感染細(xì)胞1小時(shí)LC3-Ⅱ的表達(dá)量顯著高于親本株(p＜0.01)，親本株在感染2小時(shí)后才出現(xiàn)LC3-Ⅱ的表達(dá)量上調(diào)。為了探明sodA缺失菌影響細(xì)胞自噬的機(jī)制，采用檢測(cè)超氧根離子的探針分子二氫乙錠(Dihydroethidium-DHE)及檢測(cè)過氧化氫探針2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(dihydrodichlorofl

8、uorescein diacetate-H2DCF-DA)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)菌感染RAW264.7細(xì)胞1小時(shí)和2小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)的ROS變化。結(jié)果顯示，△sodA株細(xì)胞內(nèi)ROS的量顯著高于野生菌株(p＜0.05)，而細(xì)胞內(nèi)H2O2的變化差異不顯著。且sodA缺失株，在百草枯中相對(duì)親本株，生長(zhǎng)速度變慢。大腸桿菌表達(dá)的豬鏈球菌2型SodA蛋白，具有催化活性，可快速清除體外黃嘌呤-次黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的ROS。因此，豬鏈球菌2型可能利用Sod

9、A降低感染細(xì)胞內(nèi)的ROS，從而延緩細(xì)胞自噬。
　　2.豬鏈球菌2型Stp1具有去磷酸化作用，介導(dǎo)對(duì)小鼠的致病性
　　stp1是豬鏈球菌2型編碼絲氨酸/蘇氨酸去磷酸酶的基因，該酶是依賴金屬離子的水解酶，進(jìn)行去磷酸化反應(yīng)。為了研究stp1基因在豬鏈球菌2型致病中的作用，利用同源重組方法構(gòu)建了stp1基因缺失株，分析stp1基因缺失對(duì)細(xì)胞黏附和小鼠致病力的影響。結(jié)果顯示，缺失stp1基因(△stp1)對(duì)于bEnd.3和HEp-2細(xì)

10、胞的黏附能力顯著上升，△stp1對(duì)bEnd.3細(xì)胞粘附率為1.9‰，而親本株為0.3‰(p＜0.01），HEp-2細(xì)胞相應(yīng)的粘附率分別為1.92‰和0.40‰(p＜0.05)?！鱯tp1在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中的存活率相對(duì)于親本株顯著上升(0.79％ vs二二二0.16％，p＜0.05)。在含百草枯(20mM)的培養(yǎng)基中，△stp1的抗氧化應(yīng)激能力顯著高于親本株(p＜0.01）?！鱯tp1對(duì)小鼠的毒力試驗(yàn)顯示，LD50升高1.8

11、倍; stp1缺失株在小鼠臟器中的細(xì)菌載量顯著降低(p＜0.01)，表明缺失stp1細(xì)菌毒力顯著下降。用抗絲氨酸抗體檢測(cè)了二維電泳膠中親本株與△stp1缺失株蛋白表達(dá)水平差異，結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)Stp1可調(diào)控10個(gè)蛋白點(diǎn)的磷酸化。而體外磷酸化顯示，Stp1對(duì)已知底物pNPP具有去磷酸化作用，但對(duì)SodA的去磷酸化作用不顯著，有待進(jìn)一步改善方法加以證實(shí)。
　　綜上所述，本研究首次證實(shí)缺失sodA基因可增強(qiáng)豬鏈球菌2型對(duì)細(xì)胞的黏附能