艱難梭狀芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶及二元毒素的原核表達、純化.pdf

1、目的:艱難梭狀芽孢桿菌（CD）是院內感染性腹瀉最主要的病原菌之一。2010年美國衛(wèi)生保健流行病學協(xié)會和感染病協(xié)會頒布針對難辨梭菌感染(CDI)的臨床診治指南。英國把CDI列為強制上報和管理病例。國內對于CDI報道較少，原因可能是沒有快速可靠的檢測方法，而進口檢測試劑價格昂貴且國家藥監(jiān)局還沒有批準有關CD的任何檢測試劑。國外對CDI的檢測最常用的是酶免疫法(EIA)檢測谷氨酸脫氫酶（GDH）作為初篩，并聯(lián)合檢測毒素A/B。GDH是CD產毒

2、株與非產毒株的共同抗原，其產量高，GDH檢測靈敏度高，且出結果快速，是一種高效的初篩方法。新分離的高毒株亞型BI/NAP1/027產生一種新的二元毒素(CDT)，被認為是該毒株引起高發(fā)病和高死亡的最主要原因。CDT包括兩個獨立的蛋白亞基:具有酶活性的CDTa和具有結合能力的CDTb。最新研究表明感染產CDT合并TcdA和TcdB菌株的死亡率有少量雜蛋白，CDTa和CDTb純度分別為70％和60％，濃度分別為1.3mg/ml和1.0mg/

3、ml。純化的目的蛋白免疫小鼠后，小鼠均產生了抗血清，抗血清滴度為1∶105。選取GDH免疫的小鼠進行細胞融合，遺憾的是，最終目的未能篩選出可應用于GDH檢測的雜交瘤細胞。
　　 結論:pET-28-GDH的重組工程菌能夠穩(wěn)定高效、可溶性地表達目的蛋白，純化的目的蛋白純度高，具有谷氨酸脫氫酶酶活性，為制備GDH單克隆抗體奠定基礎。pET-32-CDTa與pET-32-CDTb重組質粒表達產物產量相對較少，且含有雜蛋白，可進一步通過