乙醛脫氫酶的發(fā)酵、分離及純化.pdf

1、乙醛脫氫酶（AldehydeDehydrogenase，ALDH）是參與人體內(nèi)乙醛代謝的關(guān)鍵性酶之一，能夠催化多種脂肪族和芳香族的醛類氧化為相應(yīng)的酸，從而降低醛類物質(zhì)在體內(nèi)的毒性。由此可見，乙醛脫氫酶具有潛在的重要藥用價值。目前，ALDH主要是利用色譜柱技術(shù)從微生物和動物細(xì)胞中分離提取，費(fèi)用高、純化產(chǎn)率低且難以大規(guī)模生產(chǎn)。隨著該酶的需求增大，如何簡便快速地獲得大量純化的乙醛脫氫酶成為研究的重點(diǎn)。
　　 本文以實(shí)驗(yàn)室重組得到的6株

2、畢赤酵母GS115（含ALDH基因）為出發(fā)點(diǎn)，根據(jù)酵母培養(yǎng)手冊對菌株進(jìn)行培養(yǎng)、添加甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，篩選得到1株表達(dá)水平較高的菌株，并確定了乙醛脫氫酶表達(dá)的最適條件：甲醇誘導(dǎo)最佳時間為96h，酶活可達(dá)55U/mL。將該菌株接種到20L發(fā)酵罐中，研究其高密度培養(yǎng)放大表達(dá)乙醛脫氫酶的可行性。重組酵母培養(yǎng)36h后進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)階段，48h后酶活達(dá)到最大（180U/mL），繼續(xù)誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)酶活逐漸下降。對比搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果，乙醛脫氫酶的表達(dá)量增大了2倍。發(fā)酵

3、液粗酶活性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)：以乙醛為底物，重組獲得的乙醛脫氫酶最適反應(yīng)pH為4.0，溫度為40℃，二價離子對酶活存在較大差異，其中Zn2+、Mn2+、Mg2+有激活效果，F(xiàn)e2+、Cu2+有抑制作用。
　　 電泳結(jié)果顯示發(fā)酵液中存在少量雜蛋白，需對其中的酶進(jìn)行分離純化。以PEG/（NH4）2SO4雙水相體系相圖為基礎(chǔ)，利用雙水相技術(shù)萃取乙醛脫氫酶，研究體系中PEG分子量、體系結(jié)線TLL、相比VR、pH值及添加氯化鈉對酶分配行為的影響。