耐鹽嗜堿芽孢桿菌β-葡萄糖苷酶的原核表達(dá)純化及功能研究.pdf

1、β-葡萄糖苷酶是一種能夠水解碳水化合物糖苷鍵的水解酶。它的水解特性決定其廣闊的應(yīng)用前景。β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用非常廣,在水解纖維素、生產(chǎn)低聚龍膽糖、作為風(fēng)味酶、腫瘤診斷和治療方面都具有巨大的應(yīng)用潛力。長期以來,由于酶的活力不高、酶的產(chǎn)量低及酶的比活力低等因素一直影響該酶的實際應(yīng)用。雖然β-葡萄糖苷酶在微生物中廣泛存在,但是產(chǎn)酶效率不高,難以獲得大量的產(chǎn)品。最近,來自于極端微生物體內(nèi)的β-葡萄糖苷酶成為研究的熱點(diǎn),主要是因為這些酶可能具有潛

2、在的特殊生物功能。通過基因重組技術(shù)構(gòu)建工程菌,分泌表達(dá)高活性的β-葡萄糖苷酶對研究其應(yīng)用具有重要的意義。
　　 本文選擇了耐鹽嗜堿芽孢桿菌C-125(Bacillus halodurans C-125)做為研究對象。根據(jù)網(wǎng)上公布的β-葡萄糖苷酶的序列設(shè)計引物,使用PTDS法化學(xué)合成該菌的β-葡萄糖苷酶的編碼基因Bhbgl,然后根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏愛性,對該基因進(jìn)行改造。然后將該基因構(gòu)入到原核表達(dá)載體并導(dǎo)入到大腸桿菌DH5α中,

3、構(gòu)建出高效表達(dá)該基因的生物工程菌株。并首次對重組的極端嗜堿菌β-葡萄糖苷酶進(jìn)行分離純化和有關(guān)酶學(xué)性質(zhì)的研究。
　　 以oNPGlu為底物,通過底物濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、反應(yīng)pH的考察,確定了該酶的最佳測定條件,并對該酶的pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、米氏常數(shù)、金屬離子及碳水化合物對其影響等進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明:該重組酶最適pH為7.0,最適溫度為50℃,熱穩(wěn)定性在30-50℃之間,同時具有很高的pH穩(wěn)定性。對底物oNPGlu的米