Saccharomonospora viridis α-葡萄糖苷酶基因的功能鑒定及分子改造.pdf

1、α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，EC3.2.1.20)是一類從含有α-糖苷鍵底物的非還原末端催化水解α-葡萄糖基酶的總稱。該酶是工業(yè)上生產(chǎn)低聚異麥芽糖的關(guān)鍵酶制劑，低聚異麥芽糖是一種功能性低聚糖，具有良好的促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)、降低血脂和抗齲齒等生物性功能，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。因此，α-葡萄糖苷酶在低聚異麥芽糖的工業(yè)生產(chǎn)上受到了極度的關(guān)注。
　　 本研究利用PCR的方法從綠色糖單孢菌(S.viridis)中克隆

2、到一個(gè)假定為糖苷酶的ORF，并成功在E.coli Rossetta(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，研究表明該ORF是編碼一種α-葡萄糖苷酶。利用鎳柱將重組酶pSE380-Svg進(jìn)行純化，SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化的目的蛋白條帶約為53 kD。重組酶作用于對(duì)硝基苯基-α-D-葡萄糖苷(pNPG)和蔗糖的最適溫度分別為45℃和50℃，最適pH均為7.5，Km值分別為2.32 mmol/L和6.05 mmol/L，比活力分別為911.68 U/mg和

3、189.80 U/mg。該酶能夠水解pNPG、蔗糖、麥芽糖和麥芽三糖，但不能水解海藻糖、α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、普魯蘭糖、可溶性淀粉、糯米淀粉。
　　 本研究還通過SWISS-MODEL網(wǎng)站對(duì)S.viridisα-葡萄糖苷酶進(jìn)行同源建模，以Pseudomonas mesoacidophila的蔗糖異構(gòu)酶(2pwfD)為模板進(jìn)行比對(duì)分析，確定了活性位點(diǎn)入口附近的F282、W260和R266進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，以期提高α-葡萄糖苷酶的

4、酶活力或改變產(chǎn)物特異性。通過反向PCR和突變體庫的構(gòu)建，從中篩選到三個(gè)有活力的突變體：F282L、R2661和R266Y。利用底物pNPG對(duì)突變酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，與野生酶相比較，突變酶的比活力大大的降低，最適pH均沒有發(fā)生改變；突變酶F282L和R266Y的最適溫度分別升高和降低了5℃，而R2661的最適溫度卻沒有發(fā)生變化；突變酶R266Y的Km比野生酶的有所降低，這說明其與底物pNPG的親和力加強(qiáng)了，其余兩個(gè)突變酶的Km都有所升