未培養(yǎng)微生物β-葡萄糖苷酶基因的新功能鑒定以及突變研究.pdf

1、bgl1D基因(Genbank登錄號為FJ686869)是本實(shí)驗(yàn)室從宏基因組文庫中篩選得到的一個(gè)編碼β-葡萄糖苷酶活性的新基因資源。前期已經(jīng)構(gòu)建得到表達(dá)β-葡萄糖苷酶活性的重組菌株pGXAG801。該基因的生物信息學(xué)分析表明：在氨基酸水平上，Bgl1D基因編碼蛋白與已知來自肉毒桿菌脂肪酶蛋白有31％的相似性，由此推測該Bgl1D基因除具有編碼β-葡萄糖苷酶活性外，可能還具有編碼脂肪酶活性的功能，其編碼蛋白可能是一種兼職蛋白質(zhì)。在核苷酸水

2、平上，Bgl1D與已知數(shù)據(jù)庫中的脂肪酶基因相似性很低。
　　 重組菌株pGXAG801編碼目的蛋白純化后，以PNPB為底物，對其進(jìn)行了脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)的初步研究，得到以下結(jié)論：該蛋白的最適pH為9.0;最適溫度為25℃;Km為0.54mmol/L;Vmax為3.17μmol/min;最適條件下酶活為8.2U/mg;Al3+、Li+、Cu2+離子對酶反應(yīng)有激活作用，F(xiàn)e2+、Fe3+離子有抑制作用。驗(yàn)證了該基因編碼蛋白除具有β-葡萄

3、糖苷酶活性外，同時(shí)還具備脂肪酶的活性。
　　 利用易錯(cuò)PCR技術(shù)，以bgl1D基因?yàn)槟０鍢?gòu)建突變體庫，篩選得到一批克隆突變子，進(jìn)行篩選后得到突變體pGXAG801-1和pGXAG801-2，對該突變酶純化后驗(yàn)證酶活，發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶和脂肪酶活性均降低，其中1號β-葡萄糖苷酶酶活為原始菌株的30％，脂肪酶為20％，測序表明該蛋白氨基酸序列有3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，2號菌株β-葡萄糖苷酶酶活為原始菌株的20％，脂肪酶酶活喪失。測序表明該