嗜熱真菌第3家族β-葡萄糖苷酶的多樣性和分子改造.pdf

1、β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)是降解自然界中纖維物質(zhì)的關(guān)鍵限速酶，并且對(duì)于多種生物活性物質(zhì)具有轉(zhuǎn)化能力，在生物能源、食品保健和飼料行業(yè)都有廣闊的應(yīng)用前景。微生物來源的β-葡萄糖苷酶是非常重要的生物酶資源，對(duì)于微生物來源的β-葡萄糖苷酶的挖掘和新型β-葡萄糖苷酶的開發(fā)具有重要可持續(xù)發(fā)展意義。本研究以嗜熱真菌特異腐質(zhì)霉（Humicola insolens Y1 GCMCC4573）和籃狀菌（Talaromyces leycettan

2、us JCM12802）為材料，系統(tǒng)研究了第3家族β-葡萄糖苷酶的生化性質(zhì)、功能多樣性、底物結(jié)合關(guān)鍵氨基酸以及催化效率相關(guān)關(guān)鍵氨基酸，并成功對(duì)部分β-葡萄糖苷酶進(jìn)行了分子改造。主要結(jié)果如下:
　　(1)嗜熱真菌特異腐質(zhì)霉（H.insolens Y1 GCMCC4573）第3家族β-葡萄糖苷酶多樣性和底物結(jié)合研究
　　首次克隆了3個(gè)特異腐質(zhì)霉（H.insolensY1）來源的第3家族β-葡萄糖苷酶基因，并將其在畢赤酵母中成功表

3、達(dá)。分析表明，它們?cè)谛蛄猩戏謱儆诓煌z傳進(jìn)化分支，在功能上也表現(xiàn)出一定的多樣性。3個(gè)重組酶都表現(xiàn)出高溫中性(50-60℃，pH5.5-6.0)和葡萄糖耐受性好的特點(diǎn)，但底物特異性差異較大。HiBg13A和HiBg13C具有廣泛的底物特異性，對(duì)二糖底物和芳香基糖苷底物具有較好的水解能力，而HiBg13B僅對(duì)芳香基糖苷底物具有水解活性。3個(gè)重組酶中HiBg13C表現(xiàn)出最高的比活力(對(duì)pNPG158.8 U/mg，對(duì)纖維二糖56.4 U/mg

4、)和催化效率(對(duì)pNPG1557/s/mM，對(duì)纖維二糖23.0/s/mM)，且能夠很好地協(xié)同纖維素酶促進(jìn)纖維素降解，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。此外，HiBg13B的Ile48、Ile278和Thr484與HiBg13A中對(duì)于氨基酸為點(diǎn)進(jìn)行替換的突變體組合突變體獲得了對(duì)槐糖的水解活性，而對(duì)應(yīng)的HiBg13A的替換突變體嚴(yán)重失活。該項(xiàng)研究揭示了第3家族β-葡萄糖苷酶的序列多樣性與功能多樣性之間的關(guān)系，證明了與底物+1位配體單元結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)

5、。
　　(2)嗜熱真菌籃狀菌（T.leycettanus JCM12802）第3家族β-葡萄糖苷酶 Bg13ApH穩(wěn)定性改造
　　首次克隆了籃狀菌（Z.leycettanus）第3家族β-葡萄糖苷酶Bg13A，并在畢赤酵母中成功表達(dá)。純化后的重組Bg13A表現(xiàn)出優(yōu)異的酶學(xué)特性，最適反應(yīng)溫度為75℃，最適pH為4.5，且具有良好的熱穩(wěn)定性，在60℃保持穩(wěn)定。重組工程菌在3L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，粗酶液酶活高達(dá)6000U/ml。B

6、g13A催化性能突出，對(duì)pNPG比活力為905 U/mg，催化效率Kcat/Km值為9096/s/mM，對(duì)纖維二糖比活力為265.5U/mg，催化效率kcat/Km值為75.8/s/mM。其缺陷在于pH穩(wěn)定性極差。本研究通過構(gòu)建去除潛在的O-糖基化修飾位點(diǎn)的突變體證明了該酶在畢赤酵母中重組表達(dá)時(shí)發(fā)生過度的O-糖基化修飾，導(dǎo)致其pH穩(wěn)定性極差。兩個(gè)突變體均表現(xiàn)出大大改善的pH穩(wěn)定性，能夠在pH3.0-10.0保持穩(wěn)定。由于其穩(wěn)定性的提高，

7、突變體M1在酶解糖化試驗(yàn)中表現(xiàn)優(yōu)于野生型Bg13A。在添加相同酶活單位的條件下，突變體M1與纖維素酶Celluclast1.5L的協(xié)同效果與商業(yè)化β-葡萄糖苷酶Novozyme188相當(dāng)，表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。
　　(3)嗜熱真菌籃狀菌（T.leycettanus JCM12802）第3家族β-葡萄糖苷酶Bg13A對(duì)纖維二糖催化效率的改造
　　籃狀菌（T.leycettanus）第3家族β-葡萄糖苷酶Bg13A因其突出的酶學(xué)

8、性質(zhì)而具有巨大的開發(fā)價(jià)值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示Bg13A對(duì)纖維二糖的催化效率遠(yuǎn)低于對(duì)pNPG的催化效率，其主要原因是Bg13A對(duì)纖維二糖底物的親和力較低。為了針對(duì)其催化效率進(jìn)行分子改造，通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和分子對(duì)接分析找出了多個(gè)與酶催化緊密相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸殘基。進(jìn)而，通過對(duì)催化口袋附近穩(wěn)定疏水區(qū)域的破壞，突變體M36E和M36N相比野生型Bg13A對(duì)纖維二糖的Km分別降低為5.0mM和4.7mM，催化效率均提高約2.3倍;通過對(duì)氫鍵網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵氨基

9、酸殘基Arg65和Arg167成鍵能力的增強(qiáng)，突變體F66Y和E168Q相比野生型Bg13A對(duì)纖維二糖的親和力分別提高2.4倍和2倍，催化效率分別提高1.6和1.4倍。分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明，M36E和M36N主要通過增強(qiáng)疏水結(jié)合位點(diǎn)Phe258的柔性，提高其對(duì)纖維二糖底物的捕獲概率來提高酶對(duì)二糖底物的親和力，進(jìn)而提高催化效率;F66Y和E168Q則主要通過增強(qiáng)Arg65-Phe67和Arg167-Tyr202之間形成的陽(yáng)離子-π相互作