豬2型鏈球菌氨基甲酸激酶與鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的克隆與表達(dá).pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis）是一種重要的人畜共患病病原菌，能引起包括腦膜炎、敗血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎和關(guān)節(jié)炎等多種疾病。該菌有33個(gè)血清型，以2型菌的致病力最強(qiáng)。它公認(rèn)的毒力因子有莢膜多糖、溶菌酶釋放蛋白、胞外因子、溶血素等，但最近發(fā)現(xiàn)的一些菌株不具有上述一種或幾種毒力因子，卻具有強(qiáng)致病性，表明豬鏈球菌2型存在更復(fù)雜的致病機(jī)制。 本研究根據(jù)GenBank公布的豬鏈球菌2型（SS2）98HAH33株的氨基甲酸激酶

2、（carbamate kinase，CK）序列設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，在引物的5’端分別加入含有EcoRⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)序列。以SS2青海株基因組為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出CK的完整編碼基因，將其克隆入pMD18-T simple載體中，并進(jìn)一步亞克隆入pET32a（+）中，轉(zhuǎn)化E．coli BL21（DE3），篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。測(cè)序結(jié)果表明該基因長(zhǎng)度為948bp，核苷酸序列與GenBank上公布的98H

3、AH33株的ck序列完全相同。SDS-PAGE檢測(cè)表明表達(dá)出分子量約53kD的融合蛋白，經(jīng)鎳柱親和層析純化后，Western blot分析表明，此融合蛋白能與SS2青海株全菌制備的兔抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)。表明CK融合蛋白得到了成功表達(dá)。為分析氨基甲酸激酶的特性、功能奠定了基礎(chǔ)，有助于進(jìn)一步研究豬鏈球菌2型對(duì)宿主感染的分子機(jī)制。 根據(jù)豬鏈球菌2型（SS2）98HAH33株鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（Ornithine Carbamoyl t

4、ransferase，OCT）序列設(shè)計(jì)一對(duì)含NdeⅠ和HindⅢ的引物，以SS2青海株基因組為模板擴(kuò)增OCT全基因序列，克隆至pET28a（+）原核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化E．coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)OCT融合蛋白。核苷酸測(cè)序表明oct基因長(zhǎng)1014bp，與已登錄的98HAH33株oct序列同源性為100％。SDS-PAGE檢測(cè)到40kD的OCT融合蛋白，酶活性分析試驗(yàn)表明此融合蛋白具有OCT活性，最適反應(yīng)溫