減毒沙門(mén)氏菌介導(dǎo)的羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌sip基因口服核酸疫苗的研究.pdf

1、羅非魚(yú)是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)。近年來(lái)，羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病的暴發(fā)給羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。本課題，以2009年，在海南暴發(fā)的羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病為背景開(kāi)展了針對(duì)該病的口服核酸疫苗的研究。我們將編碼Sip蛋白的sip基因克隆至真核表達(dá)載體pVAX1，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pVAX1-sip，并將該重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到減毒沙門(mén)氏菌SL7207，成功構(gòu)建了以減毒沙門(mén)氏菌為載體的口服核酸疫苗。評(píng)價(jià)了疫苗的安全性、穩(wěn)定性、在羅非魚(yú)的組織分布以及口服免疫效

2、果。具體內(nèi)容包括:
　　1.羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌sip基因克隆、真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在EPC細(xì)胞的表達(dá)
　　以羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌的強(qiáng)毒力株(JF423941)的DNA為模板，PCR擴(kuò)增了sip基因，并T-克隆，質(zhì)粒測(cè)序分析，sip基因長(zhǎng)度為1002bp，編碼333個(gè)氨基酸(KJ398146.1)。在T-克隆重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，以pVAX1為載體，成功構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞，利用間接免疫

3、熒光法和蛋白免疫印跡法，證明了Sip蛋白在EPC細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和表達(dá)蛋白免疫原性。
　　2.重組減毒沙門(mén)氏菌的構(gòu)建與生物學(xué)特性鑒定
　　本章采用電轉(zhuǎn)化技術(shù)，成功將核酸疫苗質(zhì)粒導(dǎo)入了減毒沙門(mén)氏菌SL7207。對(duì)構(gòu)建的重組減毒沙門(mén)氏菌進(jìn)行了生物學(xué)特性分析，結(jié)果表明將外源基因?qū)霚p毒沙門(mén)氏菌載體菌株后，重組減毒沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)特性未發(fā)生明顯變化，與原始株趨于一致。在體外，在含抗生素培養(yǎng)環(huán)境下SL7207-pVAX1和SL7207-pV

4、AX1-sip兩株重組菌的質(zhì)粒比較穩(wěn)定，傳代50代后，質(zhì)粒穩(wěn)定性仍然在90％以上;在不含抗生素培養(yǎng)環(huán)境下，重組沙門(mén)氏菌中的質(zhì)粒穩(wěn)定性有所下降，隨著傳代數(shù)的增加，可能存在質(zhì)粒的丟失，但在35代內(nèi)，穩(wěn)定性仍然能夠在80％以上，顯示了較好的穩(wěn)定性。體內(nèi)穩(wěn)定性試驗(yàn)表明減毒沙門(mén)氏菌能夠穩(wěn)定攜帶外源基因有效侵染到羅非魚(yú)的各組織器官，為核酸疫苗發(fā)揮效果提供了前提保障，同時(shí)重組菌在免疫接種后28d，能夠完全從機(jī)體消除，也表明了該重組菌具有較好的生物安全

5、性。本章還考察了烘干和儲(chǔ)存溫度對(duì)口服免疫飼料中重組菌的影響，結(jié)果提示低溫烘干和低溫儲(chǔ)存可以降低重組菌的損失率，同時(shí)建議口服免疫飼料盡量現(xiàn)配現(xiàn)用，以保證最佳免疫效果。
　　3.核酸疫苗的安全性研究
　　本章將不同濃度的重組菌核酸疫苗SL7207-PVAX1-sip灌胃接種羅非魚(yú)，統(tǒng)計(jì)死亡率，得該重組菌對(duì)羅非魚(yú)的半數(shù)致死量(LD50)為1.7×1011 cfu/尾，該LD50值極高，表明對(duì)羅非魚(yú)的毒力極弱。以灌胃途徑免疫接種，在

6、不高于1.25×1010cfu/尾灌服劑量范圍內(nèi)，羅非魚(yú)不會(huì)出現(xiàn)死亡等異常癥狀，相對(duì)安全。以109cfu/mL，0.5mL/尾，灌胃接種羅非魚(yú)，整個(gè)試驗(yàn)期間羅非魚(yú)未發(fā)生死亡等異常，組織病理學(xué)觀察表明，對(duì)照組和免疫組的各個(gè)組織臟器均相對(duì)正常，該劑量下免疫接種不會(huì)對(duì)羅非魚(yú)造成病理?yè)p傷，是安全的?；蛘显囼?yàn)表明，在檢測(cè)敏感度為102拷貝數(shù)下，重組質(zhì)粒不會(huì)與羅非魚(yú)發(fā)生染色體整合。綜上，通過(guò)重組菌毒力試驗(yàn)，重組菌對(duì)羅非魚(yú)的病理?yè)p傷評(píng)價(jià)和外源基因

7、與宿主基因整合性三方面考察，均證實(shí)該疫苗對(duì)羅非魚(yú)是安全的。
　　4.核酸質(zhì)粒在羅非魚(yú)體內(nèi)的組織分布及陽(yáng)性表達(dá)
　　本章對(duì)核酸質(zhì)粒和表達(dá)的Sip蛋白進(jìn)行了組織分布考察，結(jié)果表明，通過(guò)PCR檢測(cè)，證明核酸質(zhì)粒可分布于羅非魚(yú)的腸道、肝臟、脾臟和腎臟;利用免疫組化方法，檢測(cè)到表達(dá)的蛋白可分布于脾臟和肝臟。核酸質(zhì)?；虮磉_(dá)的蛋白在組織內(nèi)存留的時(shí)間與免疫接種次數(shù)呈正相關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果表明，減毒沙門(mén)氏菌能夠作為核酸疫苗的運(yùn)載體，將sip基因攜帶

8、并轉(zhuǎn)移到靶組織，同時(shí)核酸疫苗質(zhì)粒能夠在羅非魚(yú)體內(nèi)進(jìn)行有效的表達(dá)，為后期免疫試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　5.重組核酸疫苗對(duì)羅非魚(yú)的免疫效果考察
　　羅非魚(yú)經(jīng)灌胃和投喂免疫飼料兩種途徑，分不同免疫次數(shù)進(jìn)行免疫接種?？疾炝嗣庖吆罅_非魚(yú)的血清總蛋白含量、血清總超氧化物歧化酶SOD含量、血清溶菌酶活性、血清補(bǔ)體C3含量、血清抗菌活性這些非特異性免疫指標(biāo)以及體液免疫指標(biāo)抗體效價(jià)和細(xì)胞免疫指標(biāo)IL-1β、TNF-α細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平。綜合評(píng)估了本