基因調(diào)控延遲減毒和提高異源抗原表達(dá)的豬霍亂沙門(mén)氏菌載體的構(gòu)建.pdf

1、基因調(diào)控延遲減毒和提高異源抗原表達(dá)的豬霍亂沙門(mén)氏菌載體的構(gòu)建ConstructionofregulateddelayedaRenumedSalmonellacholeraesuisevectorwithenhancedheterologousantigenprotein國(guó)家自然科學(xué)基金(31172300)江蘇省高校自然科學(xué)重大項(xiàng)目(12KJA230002)高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(博導(dǎo)類)(20133250110002)江蘇高校優(yōu)

2、勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心研究生：吉貞穎專業(yè)：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)導(dǎo)師：石火英教授揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院2014年5月2碩士學(xué)位論文因在沒(méi)有阿拉伯糖的動(dòng)物機(jī)體內(nèi)可以高效表達(dá)；引入的AasdA突變使減毒株(asdA一)與蛋白表達(dá)載體pAY3493(asdA)形成平衡致死系統(tǒng)，使得只有攜帶外源抗原質(zhì)粒的疫苗候選株才能穩(wěn)定地在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)復(fù)制。依據(jù)無(wú)抗性標(biāo)記缺失基因的自殺載體方法，首先分別構(gòu)建含缺失基因AP

3、crD：：T1’araCPBADcrp，AmanA，ArelA：：araCPBADlacITT和△以s臼H結(jié)構(gòu)的自殺載體；即在GenBank中搜索豬霍亂沙門(mén)氏菌的全基因序列，找到在豬霍亂沙門(mén)氏菌上擬缺失基因或啟動(dòng)子的上下游序列，在上下游基因中設(shè)計(jì)引物，以上下游基因的300bp左右為同源臂，刪除擬缺失基因或啟動(dòng)子序列，以豬霍亂沙門(mén)氏菌C783為模板，經(jīng)PCR等分子生物學(xué)技術(shù)，獲得刪除基因或啟動(dòng)子序列后與C78—3有500～600堿基的同源

4、臂序列，將此同源臂序列連接至自殺載體質(zhì)粒pREll2(pREll8)上，通過(guò)酶切鑒定和序列測(cè)定，將正確缺失基因或啟動(dòng)子序列的pREll2載體轉(zhuǎn)化至工程菌大腸桿菌z7213中，獲得自殺載體妒213(pYAs001)(APcrp：：TTaraCPBADcp)，Z7213(pYAs002)(AmanA)，x7213(pYAs003)(ArelA：：araCPBAD／ac／TT)和；c7213(pYAs004)(AasdA)。然后以豬霍亂沙門(mén)氏

5、菌強(qiáng)毒株C783為受體菌，含自殺性質(zhì)粒的Z7213為供體菌，運(yùn)用自殺載體介導(dǎo)的同源重組技術(shù)，在C78—3上分別引入AP?！蓿海篢TaraCPBADcrp，AmanA，ArelA：：araCPBAD／ac／TT和AasdA，最后獲得爐011(AP。rp：：TTaraCPBADcrp，AmanA，ArelA：：araCPBAD／ac／TT和AasdA)減毒株。2減毒豬霍亂沙門(mén)氏菌載體妒o11生物學(xué)特性的研究本論文的目的是用基因調(diào)控的方法，使

6、減毒載體在入侵宿主機(jī)體時(shí)能夠具有野生型豬霍亂沙門(mén)氏菌那樣的侵襲能力，侵入宿主后使毒力基因失表達(dá)而減毒，以保障疫苗候選株的安全性。為驗(yàn)證本研究中妒011減毒株是否達(dá)到論文設(shè)計(jì)的目的，首先將豬鏈球菌II型的6磷酸葡萄糖脫氫酶基因(6PGD)克隆插入原核表達(dá)載體pAY3493中，形成表達(dá)6PGD蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒pYA6PGD，再將pYA6PGD轉(zhuǎn)化至減毒株灼011中，成為致死／平衡系統(tǒng)的x0011(pYA6PGD)(見(jiàn)第三章)。經(jīng)過(guò)測(cè)定妒0