重組減毒豬霍亂沙門(mén)菌載體遞送異源抗原的免疫效率的評(píng)價(jià).pdf

1、豬鏈球菌病和豬圓環(huán)病毒病流傳廣泛，危害性大，給全球的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨額的經(jīng)濟(jì)損失，妨礙了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。研究這兩種病的疫苗對(duì)其防治有著重大的意義。沙門(mén)菌是一種胞內(nèi)寄生菌，具有強(qiáng)大的侵襲能力，可以在宿主的體內(nèi)生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)減毒后制備成疫苗載體攜帶外源抗原成為優(yōu)良的二聯(lián)菌苗，持續(xù)的刺激機(jī)體產(chǎn)生高效的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。本研究利用前期已經(jīng)構(gòu)建好的由阿拉伯糖調(diào)控載體菌延遲減毒和延遲表達(dá)外源抗原，提高針對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌和外源抗原免疫原性的重組減毒沙門(mén)菌

2、載體的基礎(chǔ)上，以Balb/C小鼠為模型，對(duì)來(lái)自豬鏈球菌的三個(gè)抗原和豬圓環(huán)病毒的二個(gè)Cap結(jié)構(gòu)蛋白的免疫原性進(jìn)行了評(píng)價(jià)和篩選，為構(gòu)建有效的豬霍亂沙門(mén)菌和豬鏈球菌，豬霍亂沙門(mén)菌和豬圓環(huán)病毒二聯(lián)疫苗提供理論依據(jù)。
　　1豬鏈球菌2型抗原的篩選和重組豬霍亂沙門(mén)菌株rSC0016攜帶豬鏈球菌抗原的免疫效率比較
　　烯醇化酶(Enolase，Eno)是豬鏈球菌的一種毒力因子，在豬鏈球菌對(duì)宿主的入侵和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮作用;6-磷酸葡萄糖脫氫

3、酶(6-phosphogluconate-dehydrogenase，6PGD)在多種細(xì)菌中具有較高的保守性，能針對(duì)豬鏈球菌的攻擊提供一定的保護(hù)力;表面抗原A（Surface antigen one A，SaoA）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的豬鏈球菌高度保守的表面蛋白，在豬鏈球菌感染機(jī)體的過(guò)程中主要起到協(xié)調(diào)各種毒力因子的作用。本課題組在前期的研究中已經(jīng)成功構(gòu)建了充分減毒和提高免疫原性豬霍亂沙門(mén)菌載體rSC0016;由asd+的原核表達(dá)載體pYA34

4、93分別表達(dá)豬鏈球菌的6PGD(pS-6PGD)和SaoA蛋白(pS-SaoA)。因此在本論文中，需要構(gòu)建由pYA3493表達(dá)豬鏈球菌的Eno蛋白，然后評(píng)價(jià)重組減毒豬霍亂沙門(mén)菌載體rSC0016分別遞送豬鏈球菌的抗原6PGD、SaoA和Eno蛋白的免疫原性。
　　本研究根據(jù)豬鏈球菌2型(SS2，GI:8151617)的Eno基因的序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增Eno基因(1305bp)的引物，通過(guò)酶切、連接，成功連接到原核表達(dá)載體pET28a中，

5、成為pET28a-Eno，然后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中得到BL21(pET28a-Eno);經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并純化獲得Eno蛋白;用純化的Eno蛋白免疫新西蘭大白兔得到抗Eno的多抗血清;將Eno基因插入asd+的原核表達(dá)載體pYA3493中形成pS-Eno質(zhì)粒;將質(zhì)粒pS-6PGD、pS-SaoA和pS-Eno分別轉(zhuǎn)化入重組減毒豬霍亂沙門(mén)菌載體rSC0016中，分別得到攜帶豬鏈球菌2型6PGD、SaoA和Eno基因的重組減毒豬霍亂沙

6、門(mén)菌株rSC0016（pS-6PGD）、rSC0016(pS-SaoA)和rSC0016(pS-Eno)。經(jīng)Western-Blot檢測(cè)證明rSC0016(pS-6PGD)、rSC0016(pS-SaoA)和rSC0016(pS-Eno)可以高效表達(dá)對(duì)應(yīng)的蛋白。
　　同時(shí)本研究首先檢測(cè)了含有Eno的減毒豬霍亂沙門(mén)菌rSC0016(pS-Eno)在LB中的生長(zhǎng)能力;通過(guò)口服途徑接種對(duì)其在小鼠的肝臟、脾臟以及腸道派伊爾氏淋巴結(jié)的定植能

7、力進(jìn)行了檢測(cè);隨后分別將rSC0016(pS-6PGD)、rSC0016(pS-SaoA)和rSC0016(pS-Eno)三種菌苗免疫小鼠，3周后收集陰道沖洗液和血清，隨后加強(qiáng)免疫;5周后再次收集血清和陰道沖洗液樣品，并用豬鏈球菌2型對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射攻毒，評(píng)價(jià)并比較rSC0016(pS-6PGD)、rSC0016(pS-SaoA)和rSC0016(pS-Eno)的免疫原性與保護(hù)性。結(jié)果顯示，rSC0016(pS-Eno)在LB中的生長(zhǎng)

8、速率略慢于空載體組rSC0016(pYA3493)和商用豬霍亂沙門(mén)菌弱毒疫苗株rSC0018(pYA3493);定居實(shí)驗(yàn)顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，rSC0016(pS-Eno)在各臟器上的細(xì)菌數(shù)量逐漸減少，接種后第14天，肝脾組織分離不到減毒菌株，而弱毒疫苗株rSC0018(pYA3493)則還可以被分離到，表明疫苗菌比弱毒疫苗株毒力更弱;疫苗菌在腸道派伊爾氏結(jié)第21天的數(shù)量仍有104CFU的菌，而rSC0018(pYA3493)在同一時(shí)間

9、內(nèi)數(shù)量為0，表明rSC0016(pS-Eno)在腸道淋巴結(jié)的定居能力顯著高于rSC0018(pYA3493)株。使用間接ELISA檢測(cè)小鼠血清和陰道沖洗液中針對(duì)SS2的Eno、SaoA和6PGD抗原產(chǎn)生的抗體，結(jié)果顯示這三種菌苗的抗體滴度明顯高于rSC0016(pYA3493)組(P＜0.01)，表明重組疫苗株rSC0016(pS-Eno)、rSC0016(pS-SaoA)、rSC0016(pS-6PGD)都可以引起良好的免疫應(yīng)答。其中

10、在首次免疫和加強(qiáng)免疫后，rSC0016(pS-Eno)和rSC0016(pS-SaoA)誘導(dǎo)的正對(duì)Eno和SaoA的IgG顯著高于rSC0016(pS-6PGD)產(chǎn)生的針對(duì)6PGD的IgG(P＜0.01);加強(qiáng)免疫后，rSC0016(pS-Eno)、rSC0016(pS-SaoA) rSC0016(pS-6PGD)在小鼠中誘導(dǎo)的IgA顯著高于首免產(chǎn)生的IgA，但是三種蛋白抗原誘導(dǎo)的IgA沒(méi)有顯著差異;在加強(qiáng)免疫后7d，檢測(cè)免疫小鼠肺臟和

11、脾臟中的細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ水平，結(jié)果是三種疫苗菌rSC0016(pS-Eno)、rSC0016(pS-SaoA)和rSC0016(pS-6PGD)誘導(dǎo)的IL-4和IFN-γ水平均明顯高于空載體組(P＜0.05)。其中，rSC0016(pS-SaoA)誘導(dǎo)的IL-4和IFN-γ水平均顯著rSC0016(pS-Eno)和rSC0016(pS-6PGD)誘導(dǎo)的，而rSC0016(pS-Eno)誘導(dǎo)的IL-4和IFN-γ水平也顯著高于

12、rSC0016(pS-6PGD)誘導(dǎo)的。動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)24×LD50劑量的SS2腹腔注射途徑攻毒后，免疫rSC0016(pS-SaoA)和rSC0016(pS-Eno)組的小鼠的保護(hù)效率為100％，rSC0016(pYA3493)空載體組和空白對(duì)照組小鼠在24小時(shí)內(nèi)全部死亡，而免疫rSC0016(pS-6PGD)組小鼠在7天內(nèi)陸續(xù)死亡，保護(hù)效率為0。
　　2攜帶豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的減毒豬霍亂沙門(mén)菌疫苗的構(gòu)建以及免

13、疫效力評(píng)價(jià)
　　Cap蛋白是豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因編碼的免疫保護(hù)性蛋白，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，因此cap基因是PCV2疫苗和診斷試劑的主要候選基因。
　　本研究根據(jù)豬圓環(huán)病毒2型的ORF2的cap基因和去核定位信號(hào)的dcap基因的序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增cap基因(702bp)和dcap基因(579bp)的引物，通過(guò)同源重組，成功構(gòu)建pET28a-Cap、pET28a-dCap，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21得到BL21(pET28a-

14、Cap)和BL21(pET28a-dCap);經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、純化獲得蛋白Cap和dCap;用純化的蛋白免疫新西蘭大白兔得到兔抗Cap和dCap的多抗血清;使用同源重組方法將cap基因和去核定位信號(hào)dcap基因插入asd+原核表達(dá)載體pYA3493，獲得pS-Cap和pS-dCap質(zhì)粒;將pS-Cap和pS-dCap質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入重組減毒豬霍亂沙門(mén)菌載體rSC0016中，分別得到攜帶豬圓環(huán)病毒2型cap和dcap基因的重組減毒豬霍亂沙門(mén)

15、菌株rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)。經(jīng)Western-Blot檢測(cè)證明rSC0016疫苗菌在多個(gè)部位能充分表達(dá)Cap和dCap蛋白。
　　隨后，本研究首先測(cè)定了rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)在-LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力;通過(guò)口服免疫的方式對(duì)這兩株疫苗菌在小鼠體內(nèi)的定植能力進(jìn)行了評(píng)估;隨后又以小鼠為模型評(píng)價(jià)了rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCa

16、p)誘導(dǎo)的正對(duì)豬圓環(huán)病毒的Cap和dCap蛋白的免疫應(yīng)答水平。生長(zhǎng)曲線的結(jié)果顯示，在培養(yǎng)后6h，rSC0016(pS-dCap)株的生長(zhǎng)速率顯著高于rSC0016(pS-Cap)株;定居實(shí)驗(yàn)顯示，隨著接種后時(shí)間的延長(zhǎng)，rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)株在肝臟、脾臟和腸道派伊爾氏淋巴結(jié)上的細(xì)菌數(shù)量逐漸減少;接種后第14d，肝脾上分離不到疫苗株，但是在接種后第21d，腸道派伊爾氏淋巴結(jié)中的疫苗株數(shù)量仍在104

17、CFU/g以上，并且rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)株的定居能力沒(méi)有差異;間接ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清中抗Cap和dCap的IgG水平，結(jié)果顯示rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)株在首次免疫和加強(qiáng)免疫誘導(dǎo)的針對(duì)Cap和dCap的IgG沒(méi)有差異，并都顯著高于空載體和空白對(duì)照組(p＜0.01)。二免后2周，經(jīng)腹腔注射途徑，用106TCID50劑量的PCV2病毒攻毒，攻毒后14d

18、，使用Real-time PCR的方法檢測(cè)攻毒后免疫小鼠血清中的病毒含量，以評(píng)價(jià)rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)株的保護(hù)效率。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，rSC0016(pYA3493)的空載體組病毒含量與空白對(duì)照組相同，而免疫rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)組小鼠血清中病毒含量均顯著減少(P＜0.05)。表明所構(gòu)建的rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-d

19、Cap)疫苗株對(duì)豬圓環(huán)病毒可以提供較好的保護(hù)效力。其中，免疫rSC0016(pS-dCap)株的小鼠血清中病毒拷貝數(shù)顯著低于免疫rSC0016(pS-Cap)株的小鼠血清中病毒拷貝數(shù)，表明rSC0016(pS-dCap)株比rSC0016(pS-Cap)株能提供更好的保護(hù)效力。
　　本論文通過(guò)分子克隆技術(shù)，構(gòu)建了重組減毒豬霍亂沙門(mén)菌rSC0016分別表達(dá)豬鏈球菌2型的烯醇化酶Eno蛋白、豬圓環(huán)病毒的Cap和dCap蛋白的二聯(lián)疫苗候

20、選株;使用Balb/C小鼠，分別評(píng)價(jià)了重組減毒豬霍亂沙門(mén)菌rSC0016遞送豬鏈球菌2型的三種抗原6PGD、SaoA和Eno的免疫效率，以及重組減毒豬霍亂沙門(mén)菌rSC0016遞送豬圓環(huán)病毒Cap和dCap蛋白的免疫效率;結(jié)果表明重組減毒豬霍亂沙門(mén)菌rSC0016遞送豬鏈球菌2型的SaoA和Eno蛋白的保護(hù)效率顯著高于6PGD蛋白;重組減毒豬霍亂沙門(mén)菌rSC0016遞送豬圓環(huán)病毒Cap和dCap蛋白都能誘導(dǎo)出較好的免疫應(yīng)答，并提供一定的保