豬乙型腦炎抗原表位的原核表達及以減毒沙門氏菌為載體的口服疫苗的免疫原性研究.pdf

1、乙型腦炎E蛋白是該病毒的主要的抗原蛋白，本實驗將乙腦E蛋白主要抗原片段基因串聯，包括E蛋白上兩個重要抗原域73aa～88aa,292aa～402aa，并將其定向連接至原核表達載體pET-32a(+)，構建原核表達質粒pET-EAB。將重組質粒轉入大腸桿菌Rosetta(DE3)，試驗確定表達出的目的蛋白主要以包涵體的形式存在。使用Western Blot方法對純化復性后的包涵體進行檢測，證實其具有免疫活性。從克隆質粒pET-EAB中酶切

2、出EAB基因，并與酶切回收的真核表達載體pCI-neo定向連接，構建出真核表達質粒pCI-EAB。將重組質粒pCI-EAB轉染Vero細胞，其表達產物通過RT-PCR和間接免疫熒光試驗的方法檢測出目的基因的轉錄與表達。以1×107、1×108、1×109CFU劑量口服接種BALB/c小鼠，分析其體內安全性和穩(wěn)定性。結果表明，利用該減毒沙門氏菌作為載體具有相對安全性，用限制性酶切分析鑒定證實，重組質粒在S.C500菌株在體內比較穩(wěn)定。體外

3、培養(yǎng)S.C500/pCI-EAB重組菌，分析其在體外的穩(wěn)定性，結果表明OD600nm在0.8左右質粒是比較穩(wěn)定的。以1×108CFU劑量的重組菌口服免疫小鼠，同時設含空載體沙門氏菌口服組，質粒pCI-EAB肌肉注射組和PBS口服做參比對照。檢測免疫小鼠血清抗體水平，脾臟淋巴細胞增殖功能，外周血T淋巴細胞亞群的差異。結果顯示在二免后一周和三免后一周，重組菌抗體水平與S.C500/pCI-neo空載體組差異顯著(p＜0.01)；脾臟淋巴細胞