豬乙型腦炎抗原表位的原核表達(dá)及以減毒沙門氏菌為載體的口服疫苗的免疫原性研究.pdf

1、乙型腦炎E蛋白是該病毒的主要的抗原蛋白，本實(shí)驗(yàn)將乙腦E蛋白主要抗原片段基因串聯(lián)，包括E蛋白上兩個(gè)重要抗原域73aa～88aa,292aa～402aa，并將其定向連接至原核表達(dá)載體pET-32a(+)，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-EAB。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta(DE3)，試驗(yàn)確定表達(dá)出的目的蛋白主要以包涵體的形式存在。使用Western Blot方法對(duì)純化復(fù)性后的包涵體進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)其具有免疫活性。從克隆質(zhì)粒pET-EAB中酶切

2、出EAB基因，并與酶切回收的真核表達(dá)載體pCI-neo定向連接，構(gòu)建出真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-EAB。將重組質(zhì)粒pCI-EAB轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，其表達(dá)產(chǎn)物通過RT-PCR和間接免疫熒光試驗(yàn)的方法檢測(cè)出目的基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。以1×107、1×108、1×109CFU劑量口服接種BALB/c小鼠，分析其體內(nèi)安全性和穩(wěn)定性。結(jié)果表明，利用該減毒沙門氏菌作為載體具有相對(duì)安全性，用限制性酶切分析鑒定證實(shí)，重組質(zhì)粒在S.C500菌株在體內(nèi)比較穩(wěn)定。體外

3、培養(yǎng)S.C500/pCI-EAB重組菌，分析其在體外的穩(wěn)定性，結(jié)果表明OD600nm在0.8左右質(zhì)粒是比較穩(wěn)定的。以1×108CFU劑量的重組菌口服免疫小鼠，同時(shí)設(shè)含空載體沙門氏菌口服組，質(zhì)粒pCI-EAB肌肉注射組和PBS口服做參比對(duì)照。檢測(cè)免疫小鼠血清抗體水平，脾臟淋巴細(xì)胞增殖功能，外周血T淋巴細(xì)胞亞群的差異。結(jié)果顯示在二免后一周和三免后一周，重組菌抗體水平與S.C500/pCI-neo空載體組差異顯著(p＜0.01)；脾臟淋巴細(xì)胞