斑點(diǎn)叉尾鮰NLR家族幾個(gè)免疫相關(guān)基團(tuán)的表達(dá)分析及染色體定位.pdf

1、NLRs(nucleotide-binding domain,leucine-rich repeat containing receptors)是病原識(shí)別受體家族(pathogen recognition receptors,PRRs)的重要成員,PRR通過(guò)感知與病原體相關(guān)的分子模式(pathogen-associated molecular pattems,PAMs)來(lái)識(shí)別入侵的病原體,它們?cè)谙忍烀庖咧衅鹬匾淖饔?。近年?lái),有學(xué)者對(duì)

2、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus Punctatus)NLR-A亞家族(NOD)基因(包括NOD1、NOD2、NLRC3、NLRC5和NLRX1)進(jìn)行了克隆和特征分析,并研究了愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri)誘導(dǎo)下各個(gè)基因的表達(dá)情況,然而在斑點(diǎn)叉尾鮰的養(yǎng)殖實(shí)踐中除了愛德華氏菌外,還有多種病原都給斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的損失,本文選取了最具代表性的幾種細(xì)菌和病毒——遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatard

3、a)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、鏈球菌(Streptococcus iniae)和斑點(diǎn)叉尾鮰呼腸孤病毒(Channel Catfish Hemorrhage Reovirus,CCRV)分別對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn),通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法檢測(cè)了NOD亞家族中各個(gè)基因在健康的斑點(diǎn)叉尾鮰的12種不同組織中以及在感染幾種病原后的肝臟、脾臟、

4、腸和頭腎中的時(shí)空表達(dá)特征,探討它們與斑點(diǎn)叉尾鮰先天免疫反應(yīng)的關(guān)系。同時(shí),本文還通過(guò)熒光原位雜交技術(shù)對(duì)NOD1和NOD2兩個(gè)重要基因進(jìn)行了染色體定位研究,以便從染色體水平更加直觀的進(jìn)一步了解這些基因,為將來(lái)對(duì)NODs基因的深入研究打下基礎(chǔ)。此外,本文還對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰BIRC7基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)分析,首先用RACE方法克隆了斑點(diǎn)叉尾鮰BIRC7基因(CcBIRC7),并用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了該基因在不同組織中以及在分別感染遲鈍愛德華氏菌

5、、鏈球菌和斑點(diǎn)叉尾鮰呼腸孤病毒后在頭。腎、肝臟和脾臟中的表達(dá)情況。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.斑點(diǎn)叉尾鮰NODs基因在細(xì)菌和病毒感染后的表達(dá)特征
　　所有的NODs基因在健康魚體的12種組織中(臟、脾臟、腸、頭腎、血、后腎、胃、心臟、腦、鰓、肌肉和皮膚)持續(xù)而廣泛的表達(dá),其中在血、肌肉、鰓、心臟中的表達(dá)量較高。除了在感染嗜水氣單胞菌和斑點(diǎn)叉尾鲴呼腸孤病毒后在脾臟中的表達(dá)與對(duì)照組相比呈現(xiàn)下調(diào)外,感染所有的四種病原后,NOD

6、1,NOD2,NLRC3,NLRC5在腸、肝臟和頭腎中都表現(xiàn)為大幅度的上調(diào)表達(dá)。NLRX1的表達(dá)在腸、肝臟和頭腎中上升而在脾臟中下降。在四種不同的病原中,革蘭氏陽(yáng)性菌鏈球菌最能引起NODs各基因的上調(diào)表達(dá),且上升幅度最大,而斑點(diǎn)叉尾鮰呼腸孤病毒只能引起輕微的上調(diào)表達(dá)。從不同的組織來(lái)看,NODs在肝臟中的表達(dá)變化最大,其次是頭。腎,腸,最后是脾臟。將NOD亞家族的五種基因進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NOD2的表達(dá)上調(diào)最為強(qiáng)烈,而NLRX1相對(duì)來(lái)說(shuō)變

7、化幅度不大。所有的這些數(shù)據(jù)都說(shuō)明,NODs在參與斑點(diǎn)叉尾鮰先天免疫反應(yīng)過(guò)程中表現(xiàn)出了明顯的組織特異性和病原特異性,同時(shí)各基因在受到細(xì)菌和病毒誘導(dǎo)后有著相似的表達(dá)模式,表明了它們?cè)诳辜?xì)菌和病毒過(guò)程中具有協(xié)同作用,為NODs基因在斑點(diǎn)叉尾鮰先天免疫中的重要性增添了有力的證據(jù)。
　　2.斑點(diǎn)叉尾鮰BIRC7的克隆和感染不同病原后的表達(dá)分析
　　斑點(diǎn)叉尾鮰BIRC7基因(CcBIRC7)cDNA序列全長(zhǎng)1686 bp(GenBank

8、登錄號(hào)為JQ268267),包括1194 bp開放閱讀框,93 bp5'非翻譯區(qū)以及含poly(A)信號(hào)的399 bp的3'非翻譯區(qū),編碼398個(gè)氨基酸。CcBIRC7基因包含有兩個(gè)BIR(baculoviral IAP repeats)保守結(jié)構(gòu)域和一個(gè)指環(huán)結(jié)構(gòu)。氨基酸序列同源性分析表明,CcBIRC7基因推測(cè)的氨基酸序列與羅非魚、斑馬魚BIRC7氨基酸序列的同源性分別為68.0％和62.3％,與其他物種的BIRC7氨基酸序列的同源性為

9、38％-50％,表現(xiàn)為中度保守。qRT-PCR分析結(jié)果表明,CcBIRC7基因廣泛表達(dá)于健康斑點(diǎn)叉尾鮰的12種不同組織中,其中在血液中的表達(dá)量最高。遲鈍愛德華氏菌和鏈球菌都能顯著誘導(dǎo)CcBIRC7基因的表達(dá),與細(xì)菌相比,斑點(diǎn)叉尾鮰呼腸孤病毒對(duì)CcBIRC7基因的誘導(dǎo)作用較為微弱,在脾臟中甚至抑制了該基因的表達(dá)。從表達(dá)結(jié)果中可以看出,BIRC7基因在斑點(diǎn)叉尾鮰的先天免疫系統(tǒng)中特別是在抵御細(xì)菌入侵方面發(fā)揮了重要的作用,關(guān)于BIRC7基因在魚