cfGnRH基因敲除對斑點叉尾鮰繁殖能力的影響.pdf

1、基因編輯技術(shù)是進行基因功能研究的重要工具，類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）技術(shù)是近年來發(fā)展最為蓬勃的基因編輯技術(shù)之一。這種基因編輯技術(shù)以其適用范圍廣、操作較為簡便、效率高、成本低等優(yōu)點，已經(jīng)在多種生物中成功運用，也在多種魚類中進行了實踐研究，例如斑馬魚（Danio rerio）、青鳉（Oryzias latipes）和黃顙魚（Tachysurus fulvidraco）等?；蚓庉嬙诟牧计贩N，提高生產(chǎn)效率，治療疾病等方面具有巨大

2、的潛力。
　　斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）作為美國主要淡水養(yǎng)殖品種之一，近年來其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)在運營成本增高，疾病種類劇增，其他進出口冷凍魚等多種因素影響下受到了很大的挑戰(zhàn)。利用基因編輯技術(shù)修改斑點叉尾鮰的基因組成可以極大地提高生產(chǎn)效率，然而，隨之而來的問題是由于基因編輯魚類的泄漏所帶來的生態(tài)安全隱患。絕育技術(shù)可以有效地減小或避免這些隱患。本研究前期利用TALEN和二次電穿孔的技術(shù)，在受精卵時期敲除斑點叉尾鮰的鯰

3、魚型 GnRH（cfGnRH）基因獲得P1代的父本和母本，當基因編輯的斑點叉尾鮰P1代3齡性成熟時，將其與野生型斑點叉尾鮰進行交配，獲得F1子一代。本研究分別利用 P1代和 F1代斑點叉尾鮰為材料，檢測了不同組織中cfGnRH基因突變的存在，比較了斑點叉尾鮰基因編輯型和野生型在產(chǎn)卵季節(jié)時的繁殖情況，評估了GnRH，雌二醇和睪丸素的分泌情況，以及F1代幼魚的GnRH基因突變存在的情況，對構(gòu)建基因編輯絕育生物以預防對生態(tài)環(huán)境潛在的不良影響具

4、有重要意義。主要結(jié)果如下：
　?。?）性成熟率的統(tǒng)計。本實驗利用二次電穿孔的技術(shù)對實驗組和對照組的400個卵子和相應(yīng)的受精卵進行電轉(zhuǎn)。實驗組的卵子和受精卵被電轉(zhuǎn)入TALEN質(zhì)粒，對照組的卵子和受精卵不被電轉(zhuǎn)入 TALEN質(zhì)粒。本研究在實驗組的斑點叉尾鮰P1代達到3齡時，對其進行性成熟率的統(tǒng)計。產(chǎn)卵季節(jié)時，性成熟的雌魚腹部膨大柔軟并且有彈性，生殖孔紅腫，微向外突出。性成熟的雄魚一般體色較深，生殖乳頭大且硬，頭部肌肉發(fā)達。實驗組被分為

5、突變型魚和非突變型魚，突變型的魚在分子鑒定中被發(fā)現(xiàn)其基因組DNA的cfGnRH基因位點存在突變現(xiàn)象；反之，非突變型的魚沒有被發(fā)現(xiàn)有靶向cfGnRH基因位點的突變現(xiàn)象。統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同條件下的循環(huán)系統(tǒng)中，突變型斑點叉尾鮰中只有31.25％的魚具備性成熟特征，而非突變型斑點叉尾鮰中有83.33%的魚具備性成熟特征。突變型雌魚的性成熟率（20%）略低于雄魚（36%）；非突變型雌魚的性成熟率（100%）略高于雄魚（75%）。這可能是由于突變

6、型的斑點叉尾鮰被敲除了cfGnRH基因，影響了性腺發(fā)育。由于性腺發(fā)育依賴于性激素的規(guī)律性脈沖，雌魚對于脈沖的規(guī)律性和強度要求可能更加苛刻，因而突變型的雌魚的性腺發(fā)育受到的影響更大。
　?。?）突變存在分子檢測。本研究在斑點叉尾鮰P1代達到3齡時，隨機抽取突變型斑點叉尾鮰5尾，非突變型斑點叉尾鮰6尾，以及野生型斑點叉尾鮰4尾，取腹鰭和胡須為樣品，利用Surveyor? Mutation Detection試劑盒（IA）檢測基因突變現(xiàn)

7、象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每條魚3齡時的突變現(xiàn)象檢測結(jié)果與其6月齡時的突變現(xiàn)象檢測結(jié)果完全一致。因此，隨著時間的遷移，基因突變的情況沒有改變，可以認為基因編輯技術(shù)所產(chǎn)生的基因突變可以穩(wěn)定存在。突變的穩(wěn)定存在能夠確保斑點叉尾鮰在生長過程中保持cfGnRH基因的轉(zhuǎn)錄始終受到影響，從而使得基因功能長久受到影響，進而抑制性腺的發(fā)育與成熟以及配子的產(chǎn)生。
　?。?）配對產(chǎn)卵。配對產(chǎn)卵實驗中的第一階段，共選取了3齡的具有性成熟特征的7尾突變型雄魚，1尾非

8、突變型雄魚，4尾突變型雌魚以及1尾非突變型雌魚，分別與野生型斑點叉尾鮰進行交配產(chǎn)卵（野生型♀×突變型♂，野生型♀×非突變型♂，突變型♀×野生型♂，非突變型♀×野生型♂），只有野生型的雌魚被注射LHRHa荷爾蒙催產(chǎn)。第二階段，突變型和非突變型的雌魚也被注射LHRHa荷爾蒙催產(chǎn)。第三階段，將2尾突變型的雌魚分別與1尾突變型的雄魚和1尾非突變型的雄魚進行配對（突變型♀×突變型♂，突變型♀×非突變型♂）；將1尾非突變型的雌魚與1尾突變型的雄魚進

9、行配對（非突變型♀×突變型♂），所有的雌魚和雄魚都被注射了LHRHa荷爾蒙催產(chǎn)。除此之外，5對野生型斑點叉尾鮰被兩兩配對，置于獨立的透明魚缸中進行自然產(chǎn)卵實驗，不注射任何荷爾蒙，以設(shè)置對照組。實驗結(jié)果表明，與突變型斑點叉尾鮰配對的野生型雌魚的產(chǎn)卵率為42.9%，略低于對照組（60%），受精卵的孵化率顯著低于對照組；突變型雌魚產(chǎn)卵率為25%，顯著低于對照組（60%）；5-8號突變型雄魚的生殖行為異常。這可能是由于cfGnRH基因的敲除阻礙

10、了突變型雌魚的性腺發(fā)育，使其無法順利產(chǎn)卵。并且， cfGnRH基因的敲除改變了突變型雄魚的生殖行為，從而不能給予雌魚正常的繁殖信號，不能引發(fā)野生型雌魚正常排卵。
　?。?）激素水平檢測。本研究利用酶聯(lián)免疫吸附實驗技術(shù)對P1代3齡的6尾野生型斑點叉尾鮰，12尾突變型斑點叉尾鮰以及8尾非突變型斑點叉尾鮰進行檢測。本實驗利用魚的雌二醇ELISA試劑盒對所有雌魚進行檢測，通用生物睪丸素ELISA試劑盒對所有雄魚進行檢測，以及魚的GnRH

11、ELISA試劑盒對所有魚進行檢測。實驗的結(jié)果表明，沒有參與產(chǎn)卵實驗的突變型和非突變型的斑點叉尾鮰的雌二醇和GnRH的激素水平?jīng)]有顯著差別，突變型的斑點叉尾鮰的雌二醇和 GnRH的激素水平的平均值略高于非突變型的斑點叉尾鮰。參與產(chǎn)卵實驗但并未產(chǎn)卵或授精的斑點叉尾鮰中，不同組別的雌二醇和 GnRH的激素水平?jīng)]有顯著差別，野生型斑點叉尾鮰的這2種激素水平的平均值略高于突變型和非突變型的魚。參與產(chǎn)卵實驗且產(chǎn)卵或授精的斑點叉尾鮰中，不同組別的睪丸

12、素和GnRH的激素水平?jīng)]有顯著差別，野生型斑點叉尾鮰的睪丸素水平的平均值略高于突變型和非突變型的魚。這可能是因為P1代實驗組的受精卵存在馬賽克現(xiàn)象，并且斑點叉尾鮰體內(nèi)還有另一種形式的GnRH的存在，因此，雌二醇和睪丸素這些類固醇類激素可能通過其他內(nèi)分泌通道被調(diào)節(jié)和釋放，并且有可能受到負反饋的調(diào)節(jié)，其激素水平反而增多。8號突變型雄魚的GnRH水平很低，并且在產(chǎn)卵實驗中未順利授精，很有可能為絕育的魚。10號突變型雌魚的雌二醇水平很低，并且在

13、產(chǎn)卵實驗中未產(chǎn)卵，很有可能為絕育的魚。
　?。?）F1代的CEL-I突變結(jié)果檢測實驗。配對實驗中，有4尾野生型的雌魚產(chǎn)卵，她們分別與編號為1-4的突變型或非突變型雄魚配對，有1尾編號為9的突變型的雌魚在與野生型雄魚配對過程中產(chǎn)卵，由此，獲得了5個家系的F1代受精卵。本研究以斑點叉尾鮰F1代為實驗材料，通過CEL-I實驗分析基因突變情況，并且與父本或母本進行比較。實驗結(jié)果表明，5個家系的F1代幼魚的基因突變情況與其突變型父本或母本相