斑點(diǎn)叉尾鮰miRNA系統(tǒng)鑒定與表達(dá)特征分析.pdf

1、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)亦稱美洲鯰、溝鯰，為美國(guó)最重要的淡水養(yǎng)殖品種，其產(chǎn)量超過(guò)當(dāng)前美國(guó)淡水水產(chǎn)總產(chǎn)量的一半以上。近年來(lái)的研究表明，真核生物體內(nèi)廣泛存在著一類與轉(zhuǎn)錄后基因沉默相關(guān)的重要RNA(microRNA，簡(jiǎn)稱miRNA)，miRNA參與了包括個(gè)體時(shí)序性發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、激素分泌以及器官發(fā)育等在內(nèi)的幾乎所有已知的生物學(xué)過(guò)程。因此，我們推測(cè)miRNA在斑點(diǎn)叉尾鮰生長(zhǎng)發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等生理過(guò)程中同樣發(fā)

2、揮了重要的基因表達(dá)調(diào)控功能。目前，針對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰這一物種，國(guó)內(nèi)外已從功能基因克隆、分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)、連鎖圖譜構(gòu)建等方面開(kāi)展了廣泛的研究。但是，在本研究開(kāi)始之前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)斑點(diǎn)叉尾鮰miRNA鑒定及其生物學(xué)功能的相關(guān)研究報(bào)道。在這種情況下，本研究在國(guó)內(nèi)外率先開(kāi)展了斑點(diǎn)叉尾鮰miRNA的系統(tǒng)鑒定工作，初步研究了部分miRNA的生物學(xué)功能。
　　充分利用當(dāng)前各數(shù)據(jù)庫(kù)中已存在的基因數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miRNA，并結(jié)合分子生物學(xué)等方

3、法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證是當(dāng)前發(fā)現(xiàn)和鑒定miRNA的重要策略之一。在斑點(diǎn)叉尾鮰全基因組測(cè)序工作尚未完成的情況下，本研究利用目前所有已知魚(yú)類的miRNA序列對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰EST和GSS數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源搜索。結(jié)合miRNA前體二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，從354483個(gè)ESTs以及63402個(gè)GSS序列中共預(yù)測(cè)到16個(gè)miRNA序列，其中3對(duì)miRNA分別位于同一miRNA前體的兩臂之上——分別為ipu-miR-9-3p/5p、ipu-miR-126-3p/5p以及i

4、pu-miR-142-3p/5p。選擇斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉、脾、頭腎等5個(gè)組織對(duì)預(yù)測(cè)到的miRNA進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證，除ipu-miR-9-3p外，其它miRNA在所選擇的斑點(diǎn)叉尾鮰組織中均有表達(dá)。對(duì)16個(gè)新預(yù)測(cè)到的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)到75個(gè)靶基因，其功能涉及基礎(chǔ)代謝、生長(zhǎng)發(fā)育、免疫調(diào)控以及脅迫響應(yīng)等多個(gè)方面。
　　考慮到同源搜索等生物信息學(xué)方法主要基于miRNA進(jìn)化的保守性，不能發(fā)現(xiàn)非保守性或物種特異性的miRNA序列。本研

5、究構(gòu)建了含有斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉、肝、脾等10個(gè)組織混合樣品的小RNA文庫(kù)，采用Solexa深度測(cè)序技術(shù)系統(tǒng)開(kāi)展斑點(diǎn)叉尾鮰miRNA鑒定研究。對(duì)Solexa測(cè)序所獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，共計(jì)獲得了14，919，026個(gè)Raw reads，這些序列代表了161，288個(gè)Unique reads。將注釋后去除rRNA、scRNA等序列后的小RNA定位到斑馬魚(yú)基因組上，分析其在斑馬魚(yú)基因組上的分布情況，同時(shí)篩選潛在的miRNA基因位點(diǎn)。共計(jì)有4

6、，542，396個(gè)序列(代表了25，538 Unique sequences)被定位到斑馬魚(yú)的基因組上。通過(guò)后續(xù)的生物信息學(xué)分析，共獲得了237個(gè)保守性miRNA序列(與miRbase18.0數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列之間不多于1個(gè)堿基差異)，屬105個(gè)miRNA家族。同時(shí)，將不能比對(duì)上保守性miRNA的小RNA序列與斑馬魚(yú)基因組數(shù)據(jù)以及斑點(diǎn)叉尾鮰EST、GSS數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合miRNA前體二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，共計(jì)鑒定出45個(gè)新miRNA序列。

7、>　　在獲得大量斑點(diǎn)叉尾鮰miRNA的基礎(chǔ)上，本研究分析了新發(fā)現(xiàn)miRNA在斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉、肝、脾等10個(gè)組織中的表達(dá)特征，同時(shí)研究了新發(fā)現(xiàn)miRNA在斑點(diǎn)叉尾鮰胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式。組織表達(dá)分析結(jié)果表明，某些miRNA表現(xiàn)出一定的組織普遍性表達(dá)特征，如ipu-miR-129b，ipu-miR-7562以及ipu-miR-7553在所有10個(gè)組織中均具有較高的表達(dá)水平。此外，研究中發(fā)現(xiàn)某些miRNA具有一定的組織表達(dá)特異性——如ip

8、u-miR-7575在斑點(diǎn)叉尾鮰胃中表達(dá)較高，ipu-miR-7147和ipu-miR-203c在斑點(diǎn)叉尾鮰心臟中表達(dá)較高?；虮磉_(dá)聚類分析結(jié)果顯示，斑點(diǎn)叉尾鮰皮膚及腸組織(魚(yú)類抵抗外來(lái)病原微生物感染的第一道屏障)中的miRNA表達(dá)特征比較相似——除ipu-miR-7556、ipu-miR-7562、ipu-miR-7553以及ipu-miR-129b等4個(gè)miRNA外，多數(shù)miRNA在這兩個(gè)組織中表達(dá)量較低。為了獲取新發(fā)現(xiàn)miRNA在

9、斑點(diǎn)叉尾鮰胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)特征，我們選擇斑點(diǎn)叉尾鮰11個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期的樣本進(jìn)行miRNA表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)有23個(gè)miRNA存在顯著的時(shí)期表達(dá)差異(P＜0.05)。這些miRNA多數(shù)在胚盤(pán)形成期(1細(xì)胞期)、體節(jié)出現(xiàn)期以及出膜前期表達(dá)較高，在斑點(diǎn)叉尾鮰卵裂期的表達(dá)水平較低，推測(cè)這種miRNA表達(dá)模式可能與其參與胚胎發(fā)育過(guò)程中相關(guān)靶基因的表達(dá)調(diào)控功能有關(guān)。對(duì)新發(fā)現(xiàn)的斑點(diǎn)叉尾鮰miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，45個(gè)miRNA共預(yù)測(cè)到281個(gè)靶基因

10、，其生物學(xué)功能涉及細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化以及器官發(fā)育等多個(gè)方面。
　　肝臟是魚(yú)類體內(nèi)最主要的代謝器官及最大的消化腺，在魚(yú)類消化、代謝、解毒以及免疫等在內(nèi)的一系列生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。本研究以新克隆得到的斑點(diǎn)叉尾鮰45個(gè)新miRNA為目標(biāo)，研究了感染嗜水氣單胞菌后斑點(diǎn)叉尾鮰肝組織中miRNA的表達(dá)模式，探討了miRNA在斑點(diǎn)叉尾鮰感染嗜水氣單胞菌過(guò)程中的基因表達(dá)調(diào)控功能。結(jié)果表明，感染嗜水氣單胞菌以后，斑點(diǎn)叉尾鮰肝組織中的miRN

11、A表達(dá)模式大致可以分為2類。第一類由ipu-miR-7147、ipu-miR-7547等23個(gè)miRNA組成，這些miRNA在攻毒嗜水氣單胞菌后2h表達(dá)上升，攻毒后8h、24h以及48h多數(shù)miRNA表達(dá)下調(diào)，其中有65.22％的miRNA至少在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出表達(dá)量顯著性下調(diào)(P＜0.05)。另外一類由ipu-miR-7558a、ipu-miR-7566等22個(gè)miRNA構(gòu)成。這些miRNA在攻毒嗜水氣單胞菌后2h～24h期間多數(shù)表達(dá)

12、上調(diào)，其中ipu-miR-24b、ipu-miR-7550以及ipu-miR-7567等3個(gè)miRNA至少在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)為顯著性提高(P＜0.05);攻毒后48h，多數(shù)miRNA的表達(dá)量顯著下調(diào)，其中ipu-miR-7568和ipu-miR-7575等miRNA的表達(dá)量表現(xiàn)為極顯著性降低(P＜0.01)?？傮w而言，攻毒后2h表達(dá)上調(diào)的miRNA數(shù)量較多，攻毒后24h以及48h則有更多的miRNA表達(dá)下調(diào)。對(duì)表現(xiàn)出顯著性差異表達(dá)的miR

13、NA進(jìn)行靶基因生物學(xué)功能分析，其功能涉及斑點(diǎn)叉尾鮰免疫調(diào)控、脅迫應(yīng)激、基礎(chǔ)代謝以及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控等多個(gè)方面。
　　生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，斑點(diǎn)叉尾鮰微管相關(guān)蛋白基因RP/EB家族EB1基因的3'-UTR區(qū)具有ipu-miR-143的潛在作用位點(diǎn)。通過(guò)分析幾種代表動(dòng)物中微管相關(guān)蛋白基因RP/EB家族EB1基因和miR-143的進(jìn)化保守性，推測(cè)ipu-miR-143在斑點(diǎn)叉尾鮰中可以通過(guò)靶向EB1基因的3'-UTR區(qū)而發(fā)揮其調(diào)控功能。因

14、此，本研究將斑點(diǎn)叉尾鮰EB1基因的3'-UTR區(qū)(含有miR-143靶位點(diǎn))構(gòu)建到pMIR-REPORTTM Luciferase載體的下游，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)ipu-miR-143的靶基因進(jìn)行鑒定。采用HEK293和CCK兩種細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，兩種細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-143 mimics組熒光相對(duì)活性與對(duì)照組相比均表現(xiàn)為顯著性降低(P＜0.05)。共轉(zhuǎn)染miR-143 inhibitors后，CCK細(xì)胞中熒光素酶相對(duì)活性(

15、8.27±1.02)與對(duì)照組相比(5.44±1.51)顯著上調(diào)(P＜0.05);HEK293細(xì)胞中熒光素酶相對(duì)活性(6.29±1.19)與對(duì)照組(4.26±0.84)相比有所上升，但是無(wú)顯著性差異(P=0.064)。初步研究結(jié)果提示，miR-143可以通過(guò)靶向EB1基因的3'-UTR區(qū)而發(fā)揮其調(diào)控功能，本研究為后續(xù)深入研究斑點(diǎn)叉尾鮰EB1基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制積累了資料。
　　總之，本研究在國(guó)內(nèi)外率先開(kāi)展了斑點(diǎn)叉尾鮰miRNA的克隆