斑點叉尾鮰病毒囊膜蛋白的鑒定及定位研究.pdf

1、斑點叉尾鮰病毒(CCV)是最早被發(fā)現(xiàn)的魚類皰疹病毒。因為通過SignaIP3.0(Bendtsen et al.2004)and SOSUI(Hirokawa et al.1998)計算程序，orf10被預(yù)測編碼Ⅰ型囊膜蛋白。該囊膜蛋白具有一個潛在的裂解信號序列(amino acids，aa1-24)和一個跨膜區(qū)(amino acids，aa101-123)，所以使用E.coli表達(dá)orf10，表達(dá)的產(chǎn)物作為抗原用來制備抗體。本研究分為

2、兩部分：第一部分研究orf10基因編碼的囊膜蛋白的功能特性和定位；第二部分是選擇orf6基因研究了斑點叉尾鮰病毒PCR-ELISA檢測方法以及該基因原核表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性。主要取得以下結(jié)果：
　　 1、成功地克隆了CCV的orf10基因。orf10有456bp，通過序列比對，和α皰疹病毒科其他已知的種類沒有很大的同源性。通過斑點雜交分析，估計的蛋白分子質(zhì)量接近35 kDa，比理論的分子質(zhì)量稍大(16 kDa)。這個差異有兩個原因

3、引起，一是轉(zhuǎn)譯后修飾，二是和別的囊膜蛋白產(chǎn)生相互作用。同時，完整粒子和囊膜在斑點雜交中的兩條帶存在2 kDa的差異，這可能是因為二硫鍵和/或糖基化作用，因為orf10被預(yù)測存在兩個潛在的N-糖基化位點，分別在Asn64和Asn84。同樣在原核表達(dá)系統(tǒng)中，orf10基因表達(dá)的蛋白也顯示了同樣分子質(zhì)量，和預(yù)期的大小一致，同樣缺少翻譯后修飾。
　　 2、成功地確定了orf10基因在病毒粒子的位置?；诎唿c雜交試驗和免疫電子顯微實驗，基

4、因orf10編碼的蛋白被證明是一個囊膜蛋白。
　　 3、中和實驗的結(jié)果表明CCV感染力降低，可能是因為位阻現(xiàn)象或者與抗體結(jié)合的封閉作用。這些結(jié)果都說明orf10和病毒侵入有直接的關(guān)系，雖然準(zhǔn)確的機(jī)制還不是很清楚。因此，下一步的研究重點應(yīng)該是抗原表位的研究。
　　 4、通過斑點雜交試驗表明使用新型表達(dá)載體表達(dá)的orf6囊膜蛋白具有很好的免疫原性。
　　 5、根據(jù)CCV的orf6基因設(shè)計引物和捕獲探針，其中一條引物5