斑點叉尾鮰抗病免疫相關microRNA的發(fā)掘及功能預測.pdf

1、MicroRNA（miRNA）是一類在動植物體中廣泛存在的內源性非編碼小RNA分子。miRNA主要參與基因轉錄后水平的調控，在生物體發(fā)育、細胞活動、免疫功能調控及疾病發(fā)生等許多生命活動過程中發(fā)揮著重要調控作用。人和動物miRNA的研究報道較多，且日漸深入；魚類作為重要的脊椎動物，其miRNA的研究報道較少，尤其miRNA在抗病免疫調控功能方面的研究更少。為了研究魚類miRNA在免疫調控中的作用，本論文以在硬骨魚類免疫系統(tǒng)中具有較高代表性

2、的斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）為實驗動物，首先研究了免疫刺激劑脂多糖（LPS）及β-葡聚糖處理下斑點叉尾鮰免疫組織中9個免疫相關miRNA及6個細胞因子的表達變化；在此基礎上，通過二代高通量測序和生物信息學分析，構建了擬態(tài)弧菌感染前后斑點叉尾鮰免疫組織中miRNA表達譜，并對差異表達的miRNA進行了功能預測。研究結果不僅對深入了解miRNA的抗病免疫調控功能具有參考價值，并為后續(xù)miRNA功能研究奠定良好基礎。

3、本論文實驗分為兩個部分：
　　一、LPS和β-葡聚糖免疫刺激下斑點叉尾鮰免疫相關miRNA及細胞因子表達差異
　　選取平均體重為18.48±0.20 g的斑點叉尾鮰40尾，隨機分成兩組，分別腹腔注射PBS溶液和LPS溶液（5 mg/ml）0.1 ml/尾，24 h后采集斑點叉尾鮰主要免疫器官肝臟、頭腎、脾臟樣品；選取平均體重為2.20±0.02 g的斑點叉尾鮰240尾，隨機分成兩組，分別投喂基礎飼料及添加β-葡聚糖（1 g/

4、kg）的基礎飼料，進行為期30天的投喂實驗，試驗后采集斑點叉尾鮰主要免疫器官肝臟、頭腎、脾臟樣品。將采集的斑點叉尾鮰主要免疫器官肝臟、頭腎、脾臟樣品，液氮速凍，提取總 RNA，反轉錄之后通過熒光定量PCR對三個組織中的9個已知的免疫相關miRNA及6個免疫相關的細胞因子進行研究。結果表明，9個免疫相關 miRNA在肝臟、頭腎、脾臟一個或幾個組織中差異表達顯著，且主要是表達上調，但LPS處理引起的miRNA的表達變化更大。6個細胞因子在肝

5、臟、頭腎、脾臟一個或幾個組織中都差異表達，β-葡聚糖刺激引起的表達主要是下調的，而LPS引起的表達主要呈上調的。
　　二、擬態(tài)弧菌感染前后斑點叉尾鮰miRNA表達譜構建及靶基因分析
　　選取平均體重為170.08±23.75 g的斑點叉尾鮰80尾，隨機分成兩組，分別腹腔注射PBS溶液和擬態(tài)弧菌菌液（6.78×107個/ml）0.1 ml/尾，48 h后采集頭腎、脾臟組織樣品液氮速凍，-80℃保存。對樣品分別提取總RNA，檢測

6、質量合格后反轉錄成cDNA，然后通過Hiseq高通量測序技術及生物信息學分析，構建了斑點叉尾鮰擬態(tài)弧菌感染前后頭腎、脾臟組織的四個cDNA文庫。以近緣物種墨西哥脂鯉（Astyanaxmexicanus）基因組為參考基因組，對測序reads進行分類注釋，并與miRBase數(shù)據(jù)庫收錄的全部動物已知miRNA進行比對，在感染前后頭腎組織中分別鑒定了1504和1658個保守的miRNA及25和27個新miRNA；在感染前后的脾臟組織中分別鑒定了

7、1407和1258個保守的miRNA及23和15個新miRNA。通過expdiff方法對感染前后miRNA表達水平進行比較，結果發(fā)現(xiàn)，擬態(tài)弧菌感染導致頭腎中502個保守的和10個新的miRNA差異表達；而在脾臟組織中有281個保守的和6個新的miRNA差異表達。我們對這些差異表達的保守miRNA及新的miRNA進行靶基因預測分析，并對獲得的靶基因進行了功能分類富集和代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)多個靶基因富集在抗病免疫相關的通路中。
　　結論