斑點(diǎn)叉尾鮰源嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌分離、鑒定與致病機(jī)理研究.pdf

1、斑點(diǎn)叉尾鮰作為一種優(yōu)良的淡水養(yǎng)殖品種，我國(guó)于1984年引進(jìn)，目前，已推廣到30多個(gè)省市進(jìn)行養(yǎng)殖，并在一些省市形成了產(chǎn)業(yè)化發(fā)展趨勢(shì)。2004年以來(lái)，陸續(xù)在四川、重慶、貴州等地發(fā)生了一種嚴(yán)重危害斑點(diǎn)叉尾鮰健康養(yǎng)殖的急性流行性傳染病，該病具有發(fā)病突然，死亡率高，傳染快等特點(diǎn)，以體表出現(xiàn)圓形、橢圓形或不規(guī)則的褪色斑，腹水、腸炎和后腸的腸套疊為病變特征，已給當(dāng)?shù)氐陌唿c(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。具不完全統(tǒng)計(jì)，該病2004年給四川斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖造

2、成的經(jīng)濟(jì)損失在200萬(wàn)左右；而2005年的損失則在800萬(wàn)元以上，許多斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖戶因該病的發(fā)生而破產(chǎn)，嚴(yán)重挫傷了廣大養(yǎng)殖戶的養(yǎng)殖積極性。本試驗(yàn)對(duì)其病原學(xué)、病理學(xué)及致病因子的致病作用等進(jìn)行了研究，其目的在于搞清該病的病原與致病機(jī)理，為養(yǎng)殖生產(chǎn)中有效地診斷和防治該病提供科學(xué)依據(jù)。 從發(fā)生斑點(diǎn)叉尾鮰急性流行性傳染病病魚(yú)的肝、腎內(nèi)分離到致病性的菌株(CCF00024)，經(jīng)人工感染試驗(yàn)證實(shí)其為斑點(diǎn)叉尾鮰急性流行性傳染病的病原菌。對(duì)該菌

3、的形態(tài)、生理生化檢測(cè)表明，其為非發(fā)酵型，嚴(yán)格需氧，革蘭氏陰性直桿菌，極生多鞭毛，對(duì)除麥芽糖和甘露糖以外的多種糖類不利用產(chǎn)酸，氧化酶陰性，DNA酶、蛋白酶、脲酶、賴氨酸脫羧酶陽(yáng)性，MR、VP陰性，H2S陰性。在以該菌16SrDNA序列(GenBank登錄號(hào)AY970826)和GenBank內(nèi)同源性較高的細(xì)菌16SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，分離菌CCF00024與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(S.maltophilia)聚在一簇，其同源性在99.

4、4-99.6％，結(jié)合形態(tài)和生理生化特點(diǎn)將其鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(S.maltophilia)。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明磺胺甲噁唑、磺胺異噁唑、阿齊霉素、洛美沙星對(duì)其敏感，新霉素、卡那霉素、氨芐青霉素、頭孢唑啉、先鋒霉素V和鏈霉素等不敏感。 對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰S.maltophilia自然和人工感染進(jìn)行了系統(tǒng)的病理學(xué)研究，結(jié)果表明該菌感染斑點(diǎn)叉尾鮰眼觀病變主要表現(xiàn)為體表充血、出血和褪色斑，腹部膨大，腹腔內(nèi)充有淡黃色或帶血的腹水，胃腸道粘膜充血

5、、出血，腸腔內(nèi)充滿淡黃色或含血的粘液，腸道發(fā)生套疊，甚至腸脫。病理組織學(xué)上，腎間質(zhì)水腫，造血組織壞死，巨噬細(xì)胞和中性白細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性和壞死；肝水腫，狄氏間隙增寬，肝細(xì)胞空泡變性及壞死；胃腸道粘膜上皮變性、壞死，脫落，固有膜，粘膜下層水腫，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性白細(xì)胞浸潤(rùn)；脾淤血，出血，淋巴細(xì)胞減少，大量巨噬細(xì)胞和中性白細(xì)胞浸潤(rùn)；骨骼肌變性、壞死，大量中性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。細(xì)胞病理學(xué)上，病魚(yú)主要器官的細(xì)胞均有較為嚴(yán)

6、重的損傷，細(xì)胞腫脹，超微結(jié)構(gòu)破壞，特別是線粒體和細(xì)胞核的損傷很明顯。線粒體表現(xiàn)為腫脹，嵴斷裂，斷裂或溶解消失，呈空囊狀；細(xì)胞核變形、染色質(zhì)溶解或發(fā)生濃縮、裂解邊移，甚至形成類似凋亡小體的結(jié)構(gòu)。 對(duì)S.maltophilia胞外產(chǎn)物的活性和致病性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該菌胞外產(chǎn)物具有溶血活性、Vero細(xì)胞毒性、腸毒性、蛋白酶活性、脂酶活性和動(dòng)物致死性。其對(duì)小白鼠的LD50為4.70mg/kg，對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰的LD50為3.21mg/kg。腹

7、腔接種斑點(diǎn)叉尾鮰體表出現(xiàn)褪色斑、腹水、腸炎、腸套疊和肝、脾、腎腫大等病變，與該菌感染發(fā)病的病變相似，表明S.maltophilia胞外產(chǎn)物在其致病機(jī)制中有著重要的作用。 采用硫酸銨沉淀、DEAE-SephadexA50離子交換層析和SephadexG100凝膠層析等方法對(duì)S.maltophilia的外毒素進(jìn)行了分離、純化、生物學(xué)活性和理化特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，S.maltophilia產(chǎn)生一種單一多肽，分子量為20.76KD

8、的外毒素。該外毒素對(duì)多種動(dòng)物紅細(xì)胞具有溶血活性，能使兔回腸結(jié)扎產(chǎn)生積液反應(yīng)，致Vero細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，對(duì)Vero細(xì)胞的CD50為0.126μg；腹腔注射小鼠的LD50為2.49mg/kg，其生物學(xué)活性可被同源抗毒素中和。該毒素對(duì)熱敏感，對(duì)胰酶有抗性，活性最適pH范圍為6～9；EDTA、二硫蘇糖醇、Cd2+、Hg2+和Cu2+對(duì)外毒素活性有一定的影響，導(dǎo)致其活性的下降，而Mg2+、Zn2+、Ba2+和Mn2+對(duì)外毒素的的活性幾乎沒(méi)有影響。

9、 用純化的S.maltophilia外毒素接種健康斑點(diǎn)叉尾鮰，從病理組織形態(tài)學(xué)和血液病理學(xué)分析其對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰的致病性，結(jié)果表明，該外毒素對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰具有明顯的致病性，LD50為1.85mg/kg。病魚(yú)全身多組織和器官都具有明顯的損傷，特別是肝、腎、脾和胃腸道的損傷較為嚴(yán)重，表現(xiàn)變性和壞死，為其損傷的靶器官。染毒魚(yú)RBC和Hb含量顯著減少，WBC增加，紅細(xì)胞脆性增加，血清AST、ALT、LDH、CK活性顯著升高，血清Cr、BUN含