魚源嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌胞外蛋白酶的純化與致病性研究.pdf

1、本試驗(yàn)從嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌胞外產(chǎn)物中提純到一種胞外蛋白酶(ECPase)，并對提純的ECPase進(jìn)行了致病性研究，以期搞清胞外蛋白酶是否是致病因子，其在致病中是否起重要作用，并為養(yǎng)殖生產(chǎn)中防治該病提供理論依據(jù)。 在胰酪胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，對體外培養(yǎng)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的胞外蛋白酶(ECPase)產(chǎn)生條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)量與碳源、氮源、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值有關(guān)。其優(yōu)化產(chǎn)酶條件為：以蔗糖作為碳源，胰

2、蛋白胨作為氮源，培養(yǎng)基初始pH值為 7.0，在20℃下120r/min振蕩培養(yǎng)72h，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌可產(chǎn)生大量的 ECPase。 在優(yōu)化培養(yǎng)條件下，采用硫酸銨鹽析、DEAE-Sephadex A50離子交換層析、SDG-PAGE等方法對嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的胞外蛋白酶進(jìn)行了分離純化。結(jié)果表明嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌產(chǎn)生一種單一多肽，分子量為45.7Kda的胞外蛋白酶。 將倍比稀釋的胞外蛋白酶與96孔板培養(yǎng)的Vero細(xì)胞一起培養(yǎng)，發(fā)

3、現(xiàn)Vero細(xì)胞變性壞死，脫落，出現(xiàn)空斑；將ECPase腹腔注射小白鼠和斑點(diǎn)叉尾鲴，表現(xiàn)出很高的死亡率。其對小白鼠和斑點(diǎn)叉尾鮰的LD<,50>分別為4.33ug/g和3.49ug/g體重。接種小白鼠精神倦怠，排黏液便，剖解發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重胃腸炎癥狀，腸道擴(kuò)張，脾嚴(yán)重腫大、出血；光鏡下可見腸粘膜上皮細(xì)胞壞死脫落，心肌細(xì)胞腫脹，嚴(yán)重顆粒變性，脾臟出血，大量紅細(xì)胞浸潤。死亡斑點(diǎn)叉尾鮰鰓絲腫脹，出現(xiàn)輕微腸炎，肝、脾、腎腫大等病變；肝細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞變