斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)hepcidin抗菌肽的基因工程制備.pdf

1、我國為世界水產(chǎn)大國,也是世界上唯一水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量高于捕撈產(chǎn)量的國家。然而,亟待解決的種質(zhì)、病害與環(huán)境等關(guān)鍵問題日趨嚴(yán)重。由于細(xì)菌性感染和細(xì)菌性疾病呈上升趨勢,為解決這些問題導(dǎo)致大量抗生素的使用,不僅破壞水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)的正常菌落,而且抗生素易在動物體內(nèi)殘留?；蚬こ炭咕奶娲鷤鹘y(tǒng)抗生素或作為環(huán)保型餌料添加劑,既可以增強水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的抗病能力,又可以提高養(yǎng)殖水產(chǎn)品的質(zhì)量。
　　抗菌肽(Anti-bacterial peptides,簡

2、稱ABP)是在誘導(dǎo)的條件下,動物免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的一類對抗外源性病原體致病作用的防御性肽類活性物質(zhì),是動物免疫防御系統(tǒng)的一個重要組成部分?？咕木哂袕V譜抗菌活性,同時還具有高效的抗真菌、抗病毒和抗腫瘤活性。因此,抗菌肽類物質(zhì)在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上有廣闊的應(yīng)用前景。本研究涉及到的肝臟表達的抗菌肽hepcidin,最初是從人的血液中分離得到。目前已有的報道證明 hepcidin對革蘭氏陽性及陰性細(xì)菌均表現(xiàn)出抗菌活性,因此可以推測 hepcidin可

3、作為一種替代抗菌肽的綠色飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用。本研究選取斑點叉尾鮰為研究對象,采用重組DNA技術(shù)來制備抗菌肽。
　　本研究內(nèi)容主要分為五部分,第一部分主要是斑點叉尾鮰hepcidin原前體肽及成熟肽基因的cDNA克隆。從斑點叉尾鮰的肝臟中提取總RNA,根據(jù)已知的斑點叉尾鮰 hepcidin基因序列設(shè)計引物,以第一股cDNA為模板,利用RT-PCR技術(shù)擴增得到長度為291bp的hepcidin全長基因,再以hepcidin全長

4、基因為模板,利用巢式PCR技術(shù)分別擴增得到長度為219bp的hepcidin原前體肽基因和長度為78bp的hepcidin成熟肽基因,并進行了序列測定。Hepcidin全長基因編碼96個氨基酸殘基組成的多肽;經(jīng)信號肽預(yù)測分析,該多肽的信號肽由24個氨基酸殘基組成,成熟肽由25個氨基酸殘基組成。斑點叉尾鮰與其他生物之間 hepcidin氨基酸序列的比對結(jié)果表明:斑點叉尾鮰與其他魚類hepcidin之間氨基酸序列有較高的同源性,與哺乳動物之

5、間顯示了低的同源性,但是無論是魚類還是哺乳動物都顯示出位于多肽羧基端的8個半胱氨酸殘基的高度保守,這與hepcidin抗菌活性密切相關(guān)。
　　第二部分主要是 hepcidin原前體肽基因和成熟肽基因的表達載體構(gòu)建。以割膠純化后的原前體肽基因和成熟肽基因分別作為模板,設(shè)計含EcoR I和Hind III酶切位點的引物,分別擴增得到長度為236bp的原前體肽基因pCH和長度為95bp的成熟肽基因mCH,將pCH、mCH和表達載體pET

6、32a分別雙酶切,利用DNA重組技術(shù),在T4DNA連接酶的作用下,將pCH和mCH分別與表達載體pET32a連接。經(jīng)過菌落 PCR檢驗、雙酶切鑒定及序列測定證實:成功構(gòu)建了 pET32a-pCH和pET32a-mCH重組表達質(zhì)粒。
　　第三部分主要是pCH和mCH在大腸桿菌中的融合表達及表達產(chǎn)物的純化。將重組表達質(zhì)粒pET32a-pCH和pET32a-mCH分別轉(zhuǎn)化宿主工程菌E.coli BL21(DE3),采用25℃,終濃度為1

7、mmol/L的IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達。Tricine-SDS-PAGE分析結(jié)果表明:融合蛋白TrxA-pCH和TrxA-mCH得到了大量的表達。為了進一步獲得高純度的融合蛋白,利用IMAC即Ni-IDA瓊脂糖凝膠柱的親和作用對超聲破碎后的總蛋白液進行層析,利用梯度的咪唑進行洗脫,通過Tricine-SDS-PAGE分析證明得到高純度的TrxA-pCH和TrxA-mCH融合蛋白,其對應(yīng)的分子量分別為33kD和26kD,與推斷的分子量相符

8、。將得到的高濃度 TrxA-mCH融合蛋白進行腸激酶酶切處理。酶切后的酶切混合物再經(jīng)過超濾離心分離濃縮經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析后將含有目的蛋白mCH的凝膠進行MALDI-TOF-TOF分析,分析結(jié)果證明獲得了高純度的目的蛋白mCH。
　　第四部分主要是 mCH成熟肽的抑菌活性鑒定。抑菌活性鑒定采用瓊脂糖彌散法,以50μ g/mL氨芐青霉素為陽性對照,以無菌的ddH2O為空白對照。陽性對照產(chǎn)生了明顯的抑菌圈,而空白對照

9、未產(chǎn)生抑菌圈,說明抑菌實驗具有充分的可信度和較好的效果。mCH顯示出對革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌的抑制作用。
　　第五部分主要是兩種hepcidin成熟肽基因的cDNA串聯(lián)及其真核表達載體的構(gòu)建。根據(jù)已有的斑點叉尾鮰hepcidin成熟肽基因mCH及尼羅羅非魚hepcidin成熟肽基因mTH為模板,通過設(shè)計含有交叉互補序列的引物,利用SOE-PCR技術(shù)將mCH和mTH基因串聯(lián)擴增得到156bp的mCH-mTH片段。根據(jù)mCH-mTH的序