以大腸桿菌LTB為載體的PEDV亞單位疫苗及其佐劑研究.pdf

1、豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的以嘔吐、腹瀉脫水和對哺乳仔豬致死率高為特征的一種高度接觸性豬腸道傳染病。目前在世界范圍內(nèi)廣泛流行，尤其在亞洲國家多次爆發(fā)且致死率高，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。目前市場上已有相應(yīng)的滅活苗和弱毒苗被廣泛使用，但仍存在安全性和有效性低、成本高等缺陷，因此開發(fā)一種高效、安全、價廉的PEDV亞單位疫苗具有十分重要的意義。
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2、蛋白是PEDV編碼蛋白中的一種結(jié)構(gòu)蛋白，它能把病毒粒子吸附在宿主細(xì)胞受體上，通過膜融合滲進(jìn)細(xì)胞中，刺激宿主誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，具有PEDV抗原的作用。PEDV的核心表位(COE)存在于S蛋白的編碼基因中，被認(rèn)為是PEDV的亞單位疫苗的重要靶標(biāo)抗原。大腸桿菌不耐熱性腸毒素(heat-labile enterotoxin，LT)是一種由大腸桿菌分泌的熱不穩(wěn)定腸毒素，LT的B型亞單位(LTB)是其結(jié)合部位。LTB具有與LT相似的黏膜免疫原性和黏

3、膜免疫佐劑活性，而且無致瀉毒性，是黏膜疫苗研究的一個重要目標(biāo)蛋白。
　　本研究選取PEDV TX株S蛋白第499-638位Aa共140個aa的區(qū)段作為目標(biāo)抗原，將其對應(yīng)的核心表位COE以Linker與大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位連接，獲得目的基因COE-LTB，將回收到的COE-LTB目的片段和大腸桿菌表達(dá)載體(pQZ)用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化到DH5α中，獲得pQZ-COE-LTB質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，將pQZ-COE-LTB質(zhì)粒

4、轉(zhuǎn)化到BL21表達(dá)宿主菌中，挑取單克隆，經(jīng)L-Ara和IPTG溫敏誘導(dǎo)表達(dá)出COE-LTB融合蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)的菌體經(jīng)反復(fù)凍融和超聲破碎后，SDS-PAGE分析其為可溶性蛋白。Western Blot鑒定重組蛋白能被PEDV抗體特異性識別，具有較好的抗原性。
　　將COE-LTB融合蛋白破碎后的上清液制成白油佐劑疫苗，皮下多點注射免疫4周齡ICR小鼠，以滅活苗(CV777)為對照，首免后第14d加強(qiáng)免疫1次。分別于首免后第14d、2

5、1d、28 d和55 d采血，用PEDV ELISA抗體檢測試劑盒檢測IgG血清抗體，對重組蛋白進(jìn)行初步的免疫原性鑒定。結(jié)果顯示，試驗組在第14d的IgG抗體水平明顯高于CV777對照組，表明重組蛋白具有很好的免疫原性，但在21d、28 d、55d時呈下降趨勢。
　　為了增強(qiáng)重組蛋白的免疫原性，選取免疫增強(qiáng)劑CVC1302、CVC1303與未純化的COE-LTB融合蛋白破碎后上清液混合乳化制成疫苗，免疫4周齡的ICR小鼠，首免后第

6、14d加免一次。分別于首免后第14d、21d、28d和55 d采血，分別用瓊擴(kuò)試驗的方法檢測血清抗體，用ELISA試劑盒檢測血清IgG、腸組織sIgA水平。結(jié)果顯示，CVC1303佐劑組的IgG和sIgA抗體水平顯著高于CV777對照組，說明CVC1303能有效增強(qiáng)重組蛋白的免疫原性。
　　綜上所述，本研究成功構(gòu)建出pQZ-COE-LTB原核表達(dá)載體，并誘導(dǎo)表達(dá)出可溶性融合蛋白COE-LTB。動物試驗初步鑒定其具有較好的免疫原性，