大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)的突變型佐劑活性及其作用機(jī)制研究.pdf

1、大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基（LTB）是一種很好的粘膜免疫佐劑，已有研究發(fā)現(xiàn)，LTB可以與細(xì)胞表面神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1）結(jié)合[1]，進(jìn)而發(fā)揮佐劑效應(yīng)，除此之外，其他相關(guān)信號(hào)通路作用機(jī)制仍未有明確的報(bào)道，一直是推動(dòng)進(jìn)一步研究的瓶頸，因此，到目前為止粘膜免疫佐劑仍未被應(yīng)運(yùn)到臨床中。本研究在野生型LTB的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了4種T細(xì)胞和B細(xì)胞表位突變型，研究比較找出具有佐劑活性的突變型，進(jìn)而為L(zhǎng)TB詳細(xì)作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。
　　目的:

2、r>　　野生型LTB及其突變型的佐劑活性比較研究，初步評(píng)價(jià)LTB突變對(duì)其粘膜免疫佐劑活性的影響，找出佐劑增效相對(duì)較強(qiáng)的突變型，分析野生型LTB及其突變型的作用機(jī)制。
　　方法：
　　本研究利用高保真DNA聚合酶通過PCR的方法對(duì)LTB進(jìn)行定位突變，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET32a-LTB26、pET32a-LTB34、pET32a-LTB57和pET32a-LTB85，通過菌液PCR檢測(cè)、質(zhì)粒酶切檢測(cè)以及測(cè)序驗(yàn)證，鑒定突變型的正確

3、性，確定突變型蛋白表達(dá)的最適條件，誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，通過SDS-PAGE檢測(cè)野生型LTB及4種突變型蛋白大小，采用His標(biāo)簽純化蛋白，TGE透析復(fù)性，PEG8000對(duì)蛋白進(jìn)行濃縮，得到高純度的LTB、LTB26、LTB34、LTB57和LTB85蛋白，去除蛋白內(nèi)毒素，分別聯(lián)合VP8免疫Balb/c雌性小鼠（免疫期間小鼠生命體征正常），收集小鼠的血清和肺洗液，采用間接ELISA法檢測(cè)血清和肺洗液中的 IgG和 sIgA水平。以Anti-NLR

4、P3、Anti-AKT1、Anti-MAP2K3和Anti-MAP2K4為一抗，通過免疫組化法檢測(cè)免疫小鼠鼻粘膜組織和脾臟組織中NLRP3、AKT1、MAP2K3和MAP2K4受體的表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建pET32a-LTB26、pET32a-LTB34、pET32a-LTB57和pET32a-LTB85突變型重組質(zhì)粒。
　　2.在E.coli BL21（DE3）中表達(dá)了帶His標(biāo)簽的LTB26、LTB

5、34、LTB57和 LTB85融合蛋白。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明突變型 LTB26和LTB34聯(lián)合VP8免疫小鼠的血清和肺洗液中的特異性IgG和sIgA抗體水平明顯高于LTB聯(lián)合VP8組，初步篩選出了兩種佐劑活性進(jìn)一步提高的突變型LTB26和LTB34。
　　3.免疫組化結(jié)果顯示：NLRP3在鼻粘膜 LTB+VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐劑組中的表達(dá)量均低于VP8對(duì)照組，相似地，NLRP3在脾臟組織LTB+VP8和

6、LTB26+VP8佐劑組中的表達(dá)也表現(xiàn)出了類似的趨勢(shì)；AKT1在鼻粘膜LTB26+VP8佐劑組中表達(dá)高于VP8對(duì)照組，其余各組均低于VP8組，而AKT1在脾臟組織LTB+VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐劑組中的表達(dá)均明顯高于VP8組（P＜0.05）；MAP2K3在鼻粘膜LTB+VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐劑組中的表達(dá)均低于VP8組和LTB57+VP8組（無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異），而MAP2K3在脾臟組織LTB+

7、VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐劑組中的表達(dá)量均高于VP8和 LTB57+VP8對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MAP2K4在鼻粘膜LTB+VP8和LTB26+VP8組的表達(dá)均稍高于VP8組，而MAP2K4在脾臟組織LTB+VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐劑組中的均明顯高于VP8組和LTB57+VP8組。
　　結(jié)論：
　　1.成功表達(dá)了帶His標(biāo)簽的LTB26、LTB34、LTB57

8、和LTB85融合蛋白；
　　2.篩選出了佐劑活性進(jìn)一步增強(qiáng)的突變型 LTB26和LTB34；
　　3.初步推測(cè)NLRP3與LTB及LTB26的佐劑增效機(jī)制無(wú)關(guān)；AKT1可能與LTB26突變型的佐劑增效機(jī)制呈正相關(guān)；MAP2K4與LTB和LTB26佐劑活性呈正相關(guān)性；MAP2K3在脾臟組織中與LTB及其突變體的佐劑活性呈負(fù)相關(guān)性，而在粘膜組織中與LTB及其突變體的佐劑活性呈正相關(guān)性，這種在不同免疫組織中的異質(zhì)性以及不同突變體在