產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88-STII-LTA2-LTB融合基因在煙草中的表達.pdf

1、ETEC腸毒素分為不耐熱性腸毒素(heat-labile，LT)和耐熱性腸毒素(haeat-stable，ST)兩種，LT是由A、B兩種亞單位組成的AB5型結(jié)構(gòu)的六聚體蛋白，是目前人們發(fā)現(xiàn)的最強有力的黏膜免疫原和黏膜免疫佐劑之一。其中A亞單位具有ADP核糖基化酶活性，A亞單位通過其A2片段插入B亞單位五聚體“戒孔”中央，組成一個完整的LT分子。LT-B可與小腸黏膜上皮細胞GM1神經(jīng)節(jié)苷脂受體結(jié)合，導致有毒性的A亞單位內(nèi)在化和吸收，從而誘

2、發(fā)全身和局部抗體反應。 融合保護性抗原的LT：類全毒素具有傳輸抗原載體和免疫佐劑兩重功效。本研究利用基因工程技術(shù)，首先克隆熱穩(wěn)定性腸毒素STⅡ的抗原決定簇(CEHYRQIAKESCKKGF)與K88ac蛋白融合基因，并利用套疊PCR技術(shù)定點突變K88ac-STⅡ內(nèi)部EcoR Ⅰ、Sac Ⅰ酶切位點。將LT的A亞基的LTA1部分用以已克隆的抗原基因K88ac-STⅡ替換，并將煙草病程相關(guān)蛋白PR1a基因的信號肽分別與K88ac-S

3、TⅡ-LTA2、LTB連接，構(gòu)建到pCAMBIA2300植物高效表達載體上，即構(gòu)建了帶有信號肽的PR1as-K88ac-STⅡ-LTA2/Ubquitin-PR1as-LTB雙價植物表達載體。構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別進行PCR檢測、酶切分析及核苷酸序列分析，結(jié)果表明，插入的融合基因核苷酸序列與預期的一致，且閱讀框正確。重組質(zhì)粒通過凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101，利用農(nóng)桿菌介導的葉盤法轉(zhuǎn)化模式植物煙草。轉(zhuǎn)基因煙草經(jīng)PCR和RT-PCR初步檢測