K88ac+產(chǎn)腸毒素大腸桿菌相關(guān)新毒力因子的研究.pdf

1、豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（enterotoxigenic Escherichia coli ETEC）是引起初生和斷奶仔豬腹瀉的重要病原體之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還降低了其生產(chǎn)效率。其中K88ac+ETEC是主要的致病菌，其引起的斷奶仔豬腹瀉(porcine post-weaning diarrhea，PWD)甚至導(dǎo)致仔豬發(fā)病死亡。其主要毒力因子包括黏附素和腸毒素。而細(xì)菌鞭毛作為一種新的毒力因子，在K88ac+ ETEC致病機(jī)理中

2、的作用仍不清楚。本論文中，我們以K88ac+ETEC國(guó)內(nèi)參考株C83902(O8∶H19∶K88ac+ LT+ STa+ STb+)為研究對(duì)象，圍繞鞭毛與K88菌毛在細(xì)菌致病過程中的作用開展研究。此外通過全基因組測(cè)序，深入挖掘K88ac+ETEC中的新型毒力因子，并對(duì)其中的alpha菌毛進(jìn)行鑒定。具體的研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.K88ae+產(chǎn)腸毒素大腸桿菌鞭毛和K88菌毛的協(xié)同調(diào)控
　　盡管細(xì)菌鞭毛已經(jīng)被普遍認(rèn)為是一種毒力因子

3、，但是其在導(dǎo)致新生和斷奶仔豬腹瀉的K88ac+產(chǎn)腸毒素大腸桿菌致病機(jī)制中的作用不明晰。我們利用λ-Red同源重組技術(shù)構(gòu)建了C83902的△fliC，△faeG，△motA單基因缺失株以及△fliC△faeG雙基因缺失株，通過PCR及測(cè)序鑒定缺失株的正確。然后將表達(dá)FliC和FaeG的重組pBR322回補(bǔ)質(zhì)粒分別導(dǎo)入缺失株構(gòu)建回補(bǔ)株C83902△fliC/pfliC和C83902△faeG/pfaeG。運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、透射電鏡以及玻板凝集試驗(yàn)

4、用來確定缺失株和回補(bǔ)株的功能。細(xì)胞黏附試驗(yàn)結(jié)果顯示，△fliC和△faeG缺失株對(duì)于仔豬空腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2的黏附能力分別下降20％和96％，△fliC△faeG雙缺失株的黏附能力也下降97％，△motA缺失株和回補(bǔ)株對(duì)IPEC-J2的黏附能力與野生株相似。qRT-PCR顯示△fliC缺失株中faeG的轉(zhuǎn)錄水平較野生株顯著下降21.5％，而△faeG缺失株中fliC的表達(dá)水平是野生株的2.08倍;△motA缺失株和回補(bǔ)株中fli

5、C和faeG表達(dá)水平均恢復(fù)野生株水平。綜合以上結(jié)果，我們證明了K88+ETEC中鞭毛和K88菌毛協(xié)同調(diào)控表達(dá)。
　　2.K88ac+產(chǎn)腸毒素大腸桿菌鞭毛和K88菌毛對(duì)細(xì)菌生物被膜及群體感應(yīng)的影響
　　生物被膜保護(hù)下的細(xì)菌對(duì)各種抗生素具有高度耐性，并可逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除作用。利用C83902野生株以及已經(jīng)構(gòu)建的△fliC、△faeG缺失株，回補(bǔ)株，通過生物被膜測(cè)定試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，△fliC缺失株的生物被膜產(chǎn)生能力較野生株下降

6、47.5％，而在△faeG缺失株其生物被膜形成能力上升1.4倍。由于Ⅱ型群體感應(yīng)是大腸桿菌重要的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，且參與調(diào)控生物被膜的形成，我們檢測(cè)了AI-2分子活性并通過qRT-PCR驗(yàn)證AI-2相關(guān)基因的表達(dá)情況。相比野生株，△fliC缺失株、△faeG缺失株和△fliC△faeG雙缺失株AI-2分子活性分別下降16.2％、19.1％和21％。qRT-PCR結(jié)果顯示△fliC缺失株中l(wèi)uxS和pfs的轉(zhuǎn)錄表達(dá)減少，而在△faeG缺失株中

7、其表達(dá)顯著增加。本研究表明了鞭毛和K88菌毛在K88ac+ETEC中，對(duì)生物被膜的形成和AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)都是重要的影響因素。
　　3.細(xì)胞脂筏在產(chǎn)腸毒素大腸桿菌鞭毛介導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞促炎性反應(yīng)中的作用探析
　　脂筏是分布在細(xì)胞膜上富含膽固醇和鞘脂類物質(zhì)有序排列的微區(qū)，參與很多重要的生物學(xué)過程。為探析脂筏是否介導(dǎo)ETEC鞭毛與腸上皮細(xì)胞膜相互作用，我們使用甲基-β-環(huán)糊精(MβCD)預(yù)先處理兩種腸上皮細(xì)胞系（人結(jié)腸癌Caco

8、-2細(xì)胞和仔豬空腸上皮IPEC-J2細(xì)胞），去除其膜膽固醇，破壞脂筏結(jié)構(gòu)，然后分別與重組大腸桿菌H1、H19鞭毛素孵育;回補(bǔ)組細(xì)胞添加外源性膽固醇孵育;對(duì)照組細(xì)胞全程僅使用培養(yǎng)基孵育。最后通過熒光定量和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的方法，確定對(duì)照組、處理組和回補(bǔ)組細(xì)胞中Toll樣受體5(TLR5)相關(guān)促炎性因子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，去除膽固醇后，通過鞭毛素激活的細(xì)胞內(nèi)TLR5信號(hào)通路中白細(xì)胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)在轉(zhuǎn)錄水

9、平和蛋白表達(dá)水平上均較對(duì)照組未預(yù)先經(jīng)MβCD處理的細(xì)胞下降約33％。而回補(bǔ)組中IL-8和TNF-α的表達(dá)水平與對(duì)照組無顯著差異。本研究證明了脂筏中膜膽固醇介導(dǎo)宿主細(xì)胞對(duì)ETEC的TLR5途徑先天免疫識(shí)別。
　　4.全基因組測(cè)序K88ac+產(chǎn)腸毒素大腸桿菌C83902
　　綜合現(xiàn)有研究可知參與K88ac+ETEC致病過程中的毒力因子包括菌毛黏附素、鞭毛以及腸毒素等，為了挖掘新毒力因子并完善K88ac+ETEC的致病機(jī)制，本研究

10、通過下一代測(cè)序技術(shù)對(duì)C83902進(jìn)行全基因組測(cè)序，獲得C83902的染色體基因組。該序列含有5，148個(gè)基因，總長(zhǎng)度為4，920，255 bp，GC含量50.8％。CRISPRs分析顯示C83902雖然攜帶CRISPR1和CRISPR2，但在該菌進(jìn)化中已丟失Cas酶相關(guān)基因。前噬菌體分析表明其染色體上含有5個(gè)完整的，1個(gè)不完整以及1個(gè)潛在的前噬菌體。大腸桿菌可以分為5個(gè)遺傳譜系(phylogroup):A，B1，B2，D和E。系統(tǒng)進(jìn)化分

11、析顯示C83902屬于遺傳譜系A(chǔ)組，但與B1組的O104∶H4_2011C-3493，O103∶H2_12009以及人源ETEC菌株E24377的親緣關(guān)系更接近。對(duì)C83902的毒力因子進(jìn)行分類和比較后發(fā)現(xiàn)了K88+ETEC上未見報(bào)道的alpha菌毛，stf菌毛，sfm菌毛以及l(fā)ong polar菌毛等四種菌毛操縱子;此外，耶爾森菌強(qiáng)毒力島和Ⅵ型分泌系統(tǒng)也作為新的ETEC毒力因子，值得深入研究。
　　5.K88ac+產(chǎn)腸毒素大腸桿

12、菌alpha菌毛的克隆、表達(dá)和鑒定
　　針對(duì)全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)的多個(gè)新型毒力因子，我們選擇了alpha菌毛并對(duì)其開展了初步的鑒定工作。根據(jù)全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)分析獲得alpha菌毛操縱子由四個(gè)基因組成。通過BLAST軟件與GenBank上不同大腸桿菌全基因組序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該操縱子主要分布于ETEC，APEC，UPEC等致病菌株。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增操縱子并克隆到pET42a(+)中，IPTG誘導(dǎo)該菌毛在大腸桿菌C3040上表達(dá)，透射電鏡觀察菌毛