產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌致病特性及益生菌的篩選與疾病控制研究.pdf

1、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli.，ETEC)是一類引起人和幼畜(初生仔豬、犢牛、羔羊)腹瀉的重要病原菌，初生幼畜被ETEC感染后，常因劇烈水樣腹瀉和迅速脫水而死亡，發(fā)病率和死亡率均很高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，通過在飼料中添加抗生素進(jìn)行防治是一條最主要的途徑。但近些年來，抗生素的由于耐藥性、安全性等問題遭到了廣泛的置疑和反對，世界上很多國家都對飼料中添加抗生素實行了禁用或限用。

2、益生素(Probiotics)由于“無毒”、“無抗藥性”、“無殘留”、“無副作用”的特點(diǎn)，逐漸成為國內(nèi)外飼料添加劑研究的熱點(diǎn)。 本文利用綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein)標(biāo)記技術(shù)研究ETEC致病特性及篩選益生菌在體內(nèi)、體外進(jìn)行抑制致病菌研究，主要結(jié)果如下： 1.通過電擊轉(zhuǎn)化法，將帶有g(shù)fp標(biāo)記基因的pGLO質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化到產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌K88中，經(jīng)過紫外檢測及熒光顯微鏡檢測均發(fā)現(xiàn)標(biāo)記菌株發(fā)出

3、綠色熒光。進(jìn)一步通過分子鑒定、脂肪酸分析、血清學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)標(biāo)記菌株和原始菌株沒有差異。同時研究在不同微生物學(xué)培養(yǎng)條件如：溫度、pH值、鹽濃度培養(yǎng)條件下，標(biāo)記菌株的生長狀態(tài)和原始菌株一致。 2.建立小白鼠K88、K88-GFP攻毒模型，K88的LD50為5.53×108CFU/mL，K88-GFP的LD50為4.86×108CFU/mL。同時利用標(biāo)記菌株自發(fā)熒光的特點(diǎn)研究感染K88-GFP小白鼠的各器官致病菌的定植情況，發(fā)現(xiàn)在肝、腎

4、中細(xì)菌最多，同時在腦、肌肉中也有少量分布。并且分析感染K88的小白鼠的血液成分、血生化指標(biāo)的變化。K88對白細(xì)胞及相關(guān)指標(biāo)的影響較大，WBC、W-SCC、W-LCC顯著降低；對紅細(xì)胞及相關(guān)指標(biāo)的影響較小，僅在6hRBC、HCT、HGB降低；對血小板也有影響，PLT顯著下降，MPV有所升高。K88對血液生化指標(biāo)中反應(yīng)肝、腎功能的指標(biāo)影響較大，ALT、AST和BUN、UA顯著升高，而對反應(yīng)脂代謝的指標(biāo)無影響，TCHO、TG與對照組相比無差異

5、。 3.從土壤中篩選到的一株芽孢桿菌對K88、雞大腸桿菌、沙門氏菌有抑制作用，通過對其表型特征、生理生化特征、脂肪酸分析和16SrDNA序列分析的多相分類研究，初步確定該菌株為短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)。 4.在研究發(fā)酵動態(tài)對PBJK-2體外抑制K88、K88-GFP的影響時發(fā)現(xiàn)，30℃、pH值7.5、發(fā)酵24h的原液，同時接入PBJK-2的抑菌效果最好。在對感染K88-GFP的小白鼠模型的疾病

6、控制研究時發(fā)現(xiàn)，腹腔注射PBJK-2的小白鼠LD50是不添加PBJK-2的對照組LD50的1.34倍，延緩了小白鼠的死亡，具有一定的保護(hù)作用。由此可見，短芽孢桿菌PBJK-2在體內(nèi)、體外都能對K88起到抑制作用。 本文表明利用GFP標(biāo)記技術(shù)可以方便地檢測K88-GFP在小白鼠體內(nèi)的各器官定植及致病情況，為研究ETEC致病特性提供一種有效工具。研究表明致病菌可能具有侵襲性可以感染多種器官，感染的小白鼠血液組分中紅細(xì)胞、白細(xì)胞及相關(guān)