miRNA-21對產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌黏附Hela細胞調(diào)控機制研究.pdf

1、miR-21是近年來發(fā)現(xiàn)的一種小RNA分子，在腫瘤發(fā)生及機體免疫調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。miR-21可通過調(diào)控IL-12、TLR4和NF-kB等基因的表達，影響機體的免疫力，在抗微生物感染中發(fā)揮重要作用。經(jīng)miRNA在線靶目標預測軟件分析發(fā)現(xiàn)，miR-21靶基因中有許多黏附相關(guān)因子，而腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)通過產(chǎn)生的黏附素與細胞表面受體結(jié)合，介導細菌黏附宿主細胞，是ETEC感染致病的前

2、提條件。但有關(guān)miR-21對ETEC黏附宿主細胞的調(diào)控機制尚屬未知。為研究miR-21對ETEC黏附Hela細胞的調(diào)控作用，本研究應用脂質(zhì)體將pcDNA?6.2-GW/EmGFP-miR-21真核表達載體轉(zhuǎn)染到Hela細胞中，并按ETEC:Hela=100:1的濃度作用不同時間，利用MTT法和Giemsa染色法檢測miR-21對ETEC黏附Hela細胞的影響，同時利用實時熒光定量PCR方法檢測不同作用時間Hela細胞CCL20、TGFB

3、I、ITGB8等黏附相關(guān)基因表達變化，以揭示miRNA-21對ETEC黏附Hela細胞的影響與調(diào)控機制。主要研究結(jié)果如下：
　　 1. 將重組miR-21真核表達載體和陰性對照分別轉(zhuǎn)染到Hela細胞中，ETEC與過表達miR-21的Hela細胞相互作用不同時間后，MTT法檢測結(jié)果顯示，過表達miR-21的Hela細胞黏附的ETEC數(shù)量比轉(zhuǎn)染對照組黏附ETEC顯著減少（P＜0.05)，說明miR-21能抑制ETEC黏附Hela細胞

4、。
　　 2.ETEC黏附過表達miR-21的Hela細胞后，經(jīng)Giemsa染色后觀察，可見大量紫色的桿狀細菌緊密黏附于Hela細胞表面，細胞中藍色為細胞核。倒置顯微鏡下在每個試驗組隨機選取100個Hela細胞進行細菌計數(shù)。結(jié)果顯示，過表達miR-21的Hela細胞組黏附細菌數(shù)量要比陰性對照黏附細菌數(shù)量顯著減少（P＜0.05)，進一步證實miR-21能抑制ETEC黏附Hela細胞。
　　 3.將重組miR-21真核表達載

5、體和陰性對照分別轉(zhuǎn)染到Hela細胞中，ETEC與轉(zhuǎn)染miR-21的Hela細胞相互作用不同時間后，實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，過表達miR-21的Hela細胞與轉(zhuǎn)染陰性對照的Hela細胞相比，60min后CCL-20、TGFBI、ITBG8 mRNA表達水平分別下調(diào)1.74倍、2.11倍、3.47倍；90min后分別下調(diào)1.92倍、2.35倍、2.36倍；120min后分別下調(diào)2.33倍、3.01倍、2.49倍；150min后分別下