產(chǎn)腸毒素大腸桿菌溶血素HlyA的原核表達(dá)、多抗制備及相關(guān)功能探析.pdf

1、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是一種重要的食源性致病菌，可引起人或幼畜（初生羔羊、犢牛及斷奶仔豬）的腹瀉，是斷奶仔豬腹瀉的主要病原菌，其高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。K88ac+ETEC血清型為國(guó)內(nèi)初生及斷奶仔豬腹瀉的優(yōu)勢(shì)血清型，其主要毒力因子包括黏附素菌毛、腸毒素、內(nèi)毒素、水腫病毒素、溶血素等。ETEC的黏附素菌毛、不耐熱腸毒素(Heat-labil

2、e enterotoxin，LT)、耐熱性腸毒素(Heat-stable enterotoxin，ST)等毒力因子受到廣泛關(guān)注，但作為尿路致病性大腸桿菌(Uropathogenic Escherichia coli, UPEC)、腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhageEscherichia coli，EHEC)重要毒力因子的溶血素在ETEC致病機(jī)理中的功能卻鮮有報(bào)道，故本研究選擇K88ac+ETEC作為試驗(yàn)對(duì)象，初步探究溶血

3、素在ETEC致病中的作用。
　　通過PCR方法擴(kuò)增負(fù)責(zé)表達(dá)大腸桿菌C83902溶血素亞單位HlyC、HlyA的基因hlyC、hlyA，將其克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+)，構(gòu)建重組表達(dá)載體pEY-28a(+)-hlyCA，經(jīng)酶切驗(yàn)證、測(cè)序，確定質(zhì)粒的成功構(gòu)建。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和Ni-NTA親和層析獲得高純度的融合蛋白HlyA。純化后的重組蛋白用兩種方法免疫新西蘭白兔

4、，獲得特異性較高的兔源抗HlyA多克隆抗體血清。本研究構(gòu)建、表達(dá)并獲得高純度的融合蛋白HlyA，經(jīng)免疫后成功獲得兔源HlyA抗體，為進(jìn)一步探究大腸桿菌溶血素HlyA的生物學(xué)功能及致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　　利用ETEC標(biāo)準(zhǔn)株C83902、已構(gòu)建的溶血素hlyA基因缺失株C83902AhlyA和回補(bǔ)株C83902△hlyA/phlyA，通過熒光定量PCR從轉(zhuǎn)錄水平研究溶血素與ETEC其他重要毒力因子的關(guān)系，初步探索了溶血素在細(xì)菌胞外的存

5、在形式，并對(duì)仔豬空腸上皮細(xì)胞IPEC-J2細(xì)胞系進(jìn)行了粘附和粘附抑制試驗(yàn)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞毒性試驗(yàn)等一系列功能性探索。Real-time PCR試驗(yàn)結(jié)果表明溶血素的缺失使得sepA（編碼絲氨酸蛋白酶主要結(jié)構(gòu)亞基）的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了83％(p＜0.01)，fimH（編碼Ⅰ型菌毛主要結(jié)構(gòu)亞基）和eltB（編碼熱不穩(wěn)定腸毒素主要結(jié)構(gòu)亞基）分別下調(diào)約40％和21％(p＜0.01)，faeG（編碼K88菌毛主要結(jié)構(gòu)亞基）顯著下調(diào)了約24％(p＜

6、0.05)，而對(duì)fliC（編碼鞭毛絲蛋白主要結(jié)構(gòu)亞基）的轉(zhuǎn)錄無顯著影響。上述結(jié)果表明溶血素與絲氨酸蛋白酶可能存在相互調(diào)控機(jī)制，且溶血素的表達(dá)可能與細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附有關(guān)。對(duì)外膜囊泡(outer membrane vesicle，OMV)及溶血素進(jìn)行分離鑒定后，發(fā)現(xiàn)溶血素除游離形式存在外，還能以與外膜囊泡結(jié)合的形式存在于細(xì)菌上清中，驗(yàn)證了外膜囊泡可以作為溶血素運(yùn)輸載體的假說。IPEC-J2的細(xì)胞黏附與黏附抑制試驗(yàn)結(jié)果表明溶血素缺失株組的