表達產腸毒素性大腸桿菌STa-K99融合蛋白重組腺病毒載體的免疫學評價.pdf

1、背景:產腸毒索性大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)是全球性的引起新生犢牛、羔羊和新生仔豬/斷奶仔豬嚴重水樣腹瀉的主要病原，給畜牧業(yè)造成巨大損失。在發(fā)展中國家，ETEC也是引起兒童和旅游者腹瀉的重要病原，成為人類公共衛(wèi)生安全的重要威脅。黏附素(Adhesion)和腸毒素(Enterotoxins)作為ETEC兩類主要毒力因子通常作為產腸毒素性火腸桿菌疫苗研究的優(yōu)勢抗原。腺病毒因其具有安全性好

2、、感染能力強、蛋白表達量高等優(yōu)點，已成為新型疫苗的理想載體[9]。目前利用腺病毒載體疫苗對腸道傳染病的免疫效果研究還未見詳細報道，尤其在預防由ETEC引起的新生動物腹瀉的重組腺病毒載體疫苗免疫學評價方面尚未見報道。
　　目的:對表達產腸毒素性大腸桿菌STa-K99融合蛋白重組腺病毒載體Ad.STa-K99（實驗室前期構建并命名）進行擴增、純化，并對其進行免疫學評價研究。
　　方法:將重組腺病毒Ad.STa-K99侵染293細

3、胞進行擴增，隨后經CsCl密度梯度離心進行純化，分別通過肌肉注射、腹腔注射及灌胃免疫小鼠。同時，克隆ETEC腸毒素STa及粘附素K99融合基因STa-K99，利用原核表達載體表達融合抗原蛋白STa-K99。采用ELISA法分別檢測血清中特異性IgG、腸灌洗液中sIgA抗體、脾臟淋巴細胞增殖活性水平及CD4+、CD8+T淋巴細胞分型比值;并通過動物攻毒保護試驗對其免疫效果進行評價。對攻毒后小鼠腸組織進行病理學切片觀察。
　　結果:<

4、br>　　(1)成功擴增、純化了重組腺病毒Ad.STa-K99，病毒滴度測定結果表明重組腺病毒感染效率較高，生物活性較好。
　　(2)通過原核表達載體成功表達了融合抗原蛋白STa-K99，SDS-PAGE、WesternBlot及ELISA鑒定結果與預期相符。
　　(3)動物免疫實驗結果顯示免疫后小鼠特異性IgG、sIgA抗體及脾臟淋巴細胞增殖活性水平顯著升高，CD4+/CD8+值顯著增大。
　　(4)動物攻毒保護實驗

5、結果表明，通過腹腔注射、肌肉注射及灌胃免疫小鼠免疫保護率分別達到67％、70％及80％。
　　(5)病理學切片觀察結果表明，Ad.STa-K99免疫小鼠腸組織與粘膜均完好，微絨毛形態(tài)完整，而對照組小鼠微絨毛脫落，腸粘膜嚴重損傷。
　　結論:
　　(1)Ad.STa-K99可以通過肌肉注射、腹腔注射及灌胃方式免疫小鼠，刺激機體產生較高水平的體液免疫、細胞免疫和腸道局部粘膜免疫反應，有效保護小鼠機體免受產腸毒素性大腸桿菌強