從T細(xì)胞角度探討廣藿香酮對(duì)炎癥性腸病的免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究目的
　　炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一種病因未明的慢性腸道免疫性疾病。一般認(rèn)為IBD的發(fā)生是環(huán)境因素作用于遺傳易感者，在腸道菌群的參與下，啟動(dòng)了腸道免疫及非免疫系統(tǒng)，最終導(dǎo)致自身免疫性炎癥反應(yīng)。其中，IBD的自身免疫性特點(diǎn)與T細(xì)胞免疫應(yīng)答密切相關(guān)，特別是腸道粘膜上Th細(xì)胞亞群失衡。因此，從調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群失衡角度，尤其是Th細(xì)胞亞群，深入了解IBD多因素多靶點(diǎn)的發(fā)病機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步

2、闡明IBD的免疫發(fā)生機(jī)制有重要意義。
　　廣藿香是治療暑濕蘊(yùn)結(jié)誘發(fā)的胃腸疾患的嶺南道地藥材，具芳香化濁、開(kāi)胃止嘔、發(fā)表解暑的功效。廣藿香酮(Pogostone，PO)是廣藿香的主要有效成分。本課題組前期研究證實(shí)，廣藿香的揮發(fā)油成分可明顯緩解三硝基苯磺酸(2，4，6-Trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)誘導(dǎo)的IBD癥狀。因此，本論文擬從調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群平衡角度，觀察廣藿香酮對(duì)IBD的治療作用，并對(duì)其作用

3、機(jī)制進(jìn)行初步探討，不僅有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)IBD的免疫發(fā)生機(jī)制，更為科學(xué)闡釋廣藿香藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的科學(xué)內(nèi)涵提供依據(jù)。
　　方法
　　1.廣藿香酮對(duì)三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)IBD的治療作用
　　1)取雄性SD大鼠，設(shè)正常組(Normal)，模型組(Model)，柳氮磺吡啶組(SASP，200mg/Kg)，廣藿香酮組(PO，20，40，80mg/Kg)。除Normal組外，其余各組通過(guò)直腸灌注TNBS(25mg/Kg)制備I

4、BD模型。從造模當(dāng)天開(kāi)始，各組動(dòng)物連續(xù)7天灌腸給予相應(yīng)藥物，正常組及模型組給予等體積藥物溶劑;
　　2)以體重變化、糞便性狀、血便/便血情況建立疾病活動(dòng)指數(shù)(DiseaseActivity Index，DAI)評(píng)分體系，評(píng)價(jià)動(dòng)物。于實(shí)驗(yàn)第8天，剖取各組大鼠肛門(mén)至盲腸段結(jié)腸，對(duì)大鼠結(jié)腸組織炎癥作大體評(píng)分(Macroscopic score，MS)。結(jié)合DAI和MS評(píng)分結(jié)果，在PO實(shí)驗(yàn)組中選擇效果最優(yōu)劑量組的樣品進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn);

5、　　3)所得結(jié)腸的病變部位(距肛門(mén)端約8cm)，部分通過(guò)蘇木素/伊紅(hematoxylin-Eosin，H&E)染色法，進(jìn)行病理組織學(xué)評(píng)分(histological score，HS)，同時(shí)通過(guò)免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IHC)檢測(cè)，分析CD4、叉頭框蛋白P3(Foxp3)、IFN-γ、IL-17表達(dá)情況。此外，部分組織用于檢測(cè)組織中髓過(guò)氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)活性變化;應(yīng)用酶聯(lián)

6、免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-B)含量，同時(shí)應(yīng)用液態(tài)懸浮芯片技術(shù)檢測(cè)組織中白介素-17A(IL-17A)，IL-10，IL-4，IL-12p70，γ-干擾素(IFN-γ)含量;
　　4)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph nodes，MLN)中輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)中IFN-γ

7、、IL-4、IL-17和Foxp3表達(dá)率，分析Th1、Th2、Th17，以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)比例;同時(shí)檢測(cè)其中的Ki67、CD38/MHCⅡ表達(dá)率，以分析MLN中Th細(xì)胞的增殖和激活狀態(tài);
　　5)應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(quantitative Realtime PolymeraseChain Reaction，quantitative rt-PCR)，分析結(jié)腸組織和MLN中轉(zhuǎn)

8、錄因子(Transcriptfator, TF)T-bet, STAT1、GATA3、STAT6、STAT3、RORγt、Foxp3的mRNA相對(duì)表達(dá)量。
　　2.廣藿香酮對(duì)刀豆蛋白A(ConcanavalinA，ConA)誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖的抑制作用
　　1)廣藿香酮與未刺激的C57BL/6小鼠脾淋巴細(xì)胞共孵育48h和72h后，應(yīng)用MTS細(xì)胞增殖試劑盒測(cè)定脾細(xì)胞的相對(duì)存活率，分析廣藿香酮(5～80μM)的安全濃度;
　

9、　2)以終濃度為1μg/mL的ConA為刺激劑建立T細(xì)胞增殖模型，以廣藿香酮(20，40，80μM)干預(yù)72h。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)，以Anti-CD3、Anti-CD4、Anti-CD8抗體標(biāo)記T細(xì)胞、CFSE標(biāo)記法分析受刺激T細(xì)胞及其亞群的增殖情況;以AnnexinⅤ標(biāo)記法分析受刺激T細(xì)胞的凋亡情況;以AnnexinⅤ/碘化吡啶(PI)雙標(biāo)記法分析其周期分布情況。此外，以Anti-CD3抗體標(biāo)記T細(xì)胞，通過(guò)胞內(nèi)蛋白標(biāo)記法分析ConA刺激后

10、T細(xì)胞中CDK2、CyclinE、CDK1、Cyclin B的表達(dá)情況;
　　3)以流式微球陣列分析法(Cytometry Beads Array，CBA)分析細(xì)胞上清液中IL-6，IL-10，單細(xì)胞趨化因子蛋白-1(Monocyte chemotactic protein，MCP-1)，IFN-γ，以及腫瘤壞死因子(Tumor nerosis factor，TNF)的分泌。
　　結(jié)果
　　1.廣藿香酮對(duì)三硝基苯磺酸(

11、TNBS)誘導(dǎo)IBD的治療作用
　　1)在25mg/KgTNBS刺激下，模型組大鼠與正常組相比，出現(xiàn)體重明顯下降、稀便、血便等典型的IBD體征，伴有明顯的腸粘連、潰瘍/壞死嚴(yán)重、腸壁水腫增厚明顯等結(jié)腸病變。HE染色顯示模型組大鼠結(jié)腸黏膜出現(xiàn)明顯的透壁性炎癥，包括潰瘍、隱窩變型，黏膜及黏膜下層可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌層肥大增厚，伴有血管增生。組織中MPO活性明顯升高進(jìn)一步說(shuō)明了模型組結(jié)腸組織出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥浸潤(rùn)。相比之下，廣藿香酮可明

12、顯提高IBD模型動(dòng)物的生存質(zhì)量，使其糞便性狀逐漸恢復(fù)正常，并防止血便發(fā)生，DAI評(píng)分明顯低于模型組;同時(shí)，廣藿香酮組(40mg/Kg)的MS和HS均明顯低于Model組，廣藿香酮可減輕結(jié)腸水腫、潰瘍、壞死，降低組織中MPO活性，其中廣藿香酮(40mg/Kg)效果最優(yōu)。HE染色結(jié)果表明廣藿香酮(40mg/Kg)可促進(jìn)結(jié)腸黏膜愈合，減少潰瘍面積，促進(jìn)隱窩形態(tài)恢復(fù)正常，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，使肌層變薄，說(shuō)明廣藿香酮可有效緩解IBD的腸道炎癥反應(yīng)。

13、細(xì)胞因子譜分析結(jié)果表明，模型組大鼠結(jié)腸組織中IL-4、IL-12p70、IL-10、IL-17、TGF-β含量明顯高于正常組，而廣藿香酮(40mg/Kg)則可抑制IFN-γ、IL-12p70、IL-17、IL-10的分泌。此外，免疫組化分析結(jié)果表明，模型組大鼠結(jié)腸組織中CD4、IFN-γ、IL-17、Foxp3的表達(dá)明顯高于正常組，提示模型組大鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)明顯的Th細(xì)胞浸潤(rùn);與此相比，廣藿香酮(40mg/Kg)可明顯抑制組織中CD4、

14、IFN-γ、 IL-17的表達(dá)，減少Th細(xì)胞，尤其是Th1、Th17細(xì)胞在病變黏膜中的浸潤(rùn)。Th細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子mRNA相對(duì)表達(dá)量分析表明，模型組動(dòng)物組織中T-bet、GATA3、STAT6、Foxp3的相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常組，RORγt的表達(dá)量則明顯低于正常組;而廣藿香酮(40mg/Kg)對(duì)1BD模型動(dòng)物組織中相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的mRNA相對(duì)表達(dá)影響較小，僅使RORγt明顯提高至接近正常組。
　　2)針對(duì)MLN的分析表明，模型組大鼠ML

15、N中Th細(xì)胞的Ki67陽(yáng)性率、CD38/MHC-Ⅱ共陽(yáng)性率與正常組比較無(wú)明顯差別，廣藿香酮(40mg/Kg)對(duì)此也無(wú)明顯影響;同時(shí)，模型組大鼠MLN中Th細(xì)胞的IFN-γ、IL-17、Foxp3表達(dá)率與正常組比較無(wú)明顯差異，而IL-4表達(dá)率則明顯升高;而廣藿香酮(40mg/Kg)對(duì)MLN中Th細(xì)胞的IFN-γ、IL-4、IL-17、Foxp3的表達(dá)率無(wú)明顯影響。針對(duì)MLN中Th細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的mRNA相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果表明，與正常組比較，

16、模型組大鼠MLN中GATA3表達(dá)明顯下調(diào)的同時(shí)RORγt明顯上升，而T-bet、STAT6、STAT3、Foxp3則無(wú)明顯變化;廣藿香酮(40mg/Kg)使上述轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達(dá)恢復(fù)至接近正常組水平，其中使Foxp3的相對(duì)表達(dá)量與模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果提示在本條件下，IBD模型動(dòng)物MLN中Th細(xì)胞的激活、增殖狀態(tài)，及各亞群的分化狀態(tài)無(wú)明顯變化，廣藿香酮(40mg/Kg)對(duì)MLN中Th的上述指標(biāo)也無(wú)明顯影響。
　　2.廣藿香酮

17、對(duì)刀豆蛋白A誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖的抑制作用
　　1)結(jié)果表明，0～80μM廣藿香酮對(duì)正常脾細(xì)胞的相對(duì)活力無(wú)影響，說(shuō)明廣藿香酮在該濃度范圍內(nèi)對(duì)淋巴細(xì)胞無(wú)毒性作用。在ConA誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖模型中，由于“激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(AICD，Activation Induced Cell Death)”效應(yīng)的存在，脾淋巴細(xì)胞出現(xiàn)了輕微凋亡，同時(shí)T細(xì)胞的增殖比例，及其在脾淋巴細(xì)胞中的比例明顯升高。而廣藿香酮(20，40，80μM)在不引起細(xì)胞毒性或凋

18、亡的情況下，可明顯降低T細(xì)胞的增殖比例及其細(xì)胞比例，說(shuō)明廣藿香酮可直接抑制ConA誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖，且進(jìn)一步分析表明PO對(duì)Th中的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞同樣有直接增殖抑制作用。
　　2)細(xì)胞周期分析結(jié)果表明，廣藿香酮直接的增殖抑制活性可能與其誘導(dǎo)周期阻滯作用有關(guān)。ConA刺激后，處于S期和G2/M期的淋巴細(xì)胞比例明顯增加，且進(jìn)一步分析表明與S期的周期調(diào)控蛋白CDK2表達(dá)明顯下降，而cyclin E，以及與G2/M相關(guān)的CD

19、K1、cyclinB均明顯增加。相比之下，廣藿香酮(20，40，80μM)使S期和G2/M期的T細(xì)胞比例明顯下降，同時(shí)明顯減少cyclin E、CDK1、cyclinB的表達(dá)。上述結(jié)果提示，廣藿香酮可通過(guò)抑制增殖細(xì)胞中CDK1和CyclinB的表達(dá)，阻礙G2/M期檢查點(diǎn)行使功能，從而使已處于增殖狀態(tài)下的T細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入G2/M期，發(fā)生S期停滯，最終直接抑制了T細(xì)胞增殖。
　　3)此外，細(xì)胞因子譜分析表明，ConA刺激可使脾淋巴細(xì)胞的

20、IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ、TNF的分泌量顯著增加，而廣藿香酮(20，40，80μM)則可明顯抑制其中的促炎因子IFN-γ和抗炎因子IL-10的分泌。
　　結(jié)論
　　廣藿香酮可明顯改善IBD模型動(dòng)物的生存質(zhì)量，緩解IBD的腸道炎癥反應(yīng)，減輕結(jié)腸水腫、潰瘍、壞死，減少病變黏膜中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)黏膜愈合，說(shuō)明廣藿香酮對(duì)IBD具有一定的治療作用。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步提示，廣藿香酮的對(duì)IBD的治療作用可能與其直接的

21、免疫抑制作用有關(guān)。廣藿香酮可通過(guò)誘導(dǎo)處于增殖狀態(tài)的T細(xì)胞發(fā)生S期阻滯，對(duì)T細(xì)胞產(chǎn)生直接的增殖抑制作用，減少致炎性Th細(xì)胞Th1、Th2、Th17和免疫抑制性的Treg在病變黏膜中的浸潤(rùn)，從而減少促炎因子和抗炎因子的分泌，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡，最終鈍化適應(yīng)性免疫應(yīng)答，全面抑制IBD發(fā)展過(guò)程中的攻擊性免疫反應(yīng)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，廣藿香的特征性成分廣藿香酮對(duì)實(shí)驗(yàn)性IBD模型具有明顯的治療作用，該作用與其直接抑制T細(xì)胞增殖、緩解IBD活動(dòng)期間適