胸腺B細(xì)胞在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育中的作用研究及NK細(xì)胞在原發(fā)性膽汁性肝硬化致病機(jī)制中的研究.pdf

1、第一部分胸腺B細(xì)胞在Treg發(fā)育中的作用及機(jī)制研究
　　調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是一群對于維持機(jī)體免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要的CD4+T細(xì)胞，特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FoxP3。Treg參與多種疾病的發(fā)病，并在其中發(fā)揮重要作用，如自身免疫性疾病、感染、過敏和腫瘤等。因?yàn)門reg細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)中扮演了重要角色，將Treg細(xì)胞作為疾病治療的靶點(diǎn)極具臨床應(yīng)用前景，而探究Treg細(xì)胞的發(fā)育機(jī)制無疑為Treg細(xì)胞用于臨床疾病治療提供重要的基礎(chǔ)理論

2、參考。
　　外周免疫系統(tǒng)中的FoxP3+Treg細(xì)胞根據(jù)其來源的不同可以分為外周誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg細(xì)胞(p-Treg)和胸腺來源的Treg細(xì)胞(t-Treg)，p-Treg細(xì)胞是在外周由經(jīng)典的非Treg的CD4+T細(xì)胞在特定免疫微環(huán)境中誘導(dǎo)產(chǎn)生，而t-Treg細(xì)胞是在胸腺中由CD4單陽性胸腺細(xì)胞發(fā)育而來，t-Treg是構(gòu)成外周FoxP3+Treg細(xì)胞的主要成分。
　　t-Treg在胸腺中的發(fā)育主要分為兩個(gè)階段:第一個(gè)階段是從

3、CD4單陽性T細(xì)胞在經(jīng)過TCRβ-MHCⅡ和CD28-CD80/86選擇和刺激后生成CD25+ FoxP3-Treg前體細(xì)胞;第二個(gè)階段是從Treg前體細(xì)胞向成熟Foxp3+Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，這個(gè)過程是細(xì)胞因子IL-2所依賴的。在t-Treg的發(fā)育過程中，多種抗原遞呈細(xì)胞，如:樹突狀細(xì)胞，胸腺髓質(zhì)區(qū)上皮細(xì)胞促進(jìn)了t-Treg的發(fā)育和分化。胸腺B細(xì)胞也是正常存在于胸腺組織的一種抗原遞呈細(xì)胞，但其在胸腺發(fā)育中的作用，特別是在t-Treg發(fā)

4、育中的作用仍然不清楚，因此，我們將探究胸腺B細(xì)胞在t-Treg發(fā)育過程中所行使的功能，從而深刻認(rèn)識(shí)Treg細(xì)胞的發(fā)育機(jī)理。我們已取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.胸腺B細(xì)胞參與胸腺Treg的發(fā)育
　　通過免疫組化染色我們發(fā)現(xiàn)，胸腺B細(xì)胞和胸腺Treg細(xì)胞均定位于胸腺的髓質(zhì)區(qū);流式分析B細(xì)胞敲除的FoxP3-GFP小鼠胸腺細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)胸腺中B細(xì)胞的缺失不影響CD4單陽性和CD8單陽性胸腺細(xì)胞，但胸腺Treg細(xì)胞的比例和數(shù)目均顯著的

5、下降;同時(shí)，我們利用體外胸腺B細(xì)胞和胸腺CD4單陽性細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)直接證實(shí)了胸腺B細(xì)胞能夠誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生。
　　2.胸腺B細(xì)胞通過細(xì)胞-細(xì)胞間的接觸的方式促進(jìn)胸腺Treg細(xì)胞發(fā)育
　　通過體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)胸腺B細(xì)胞促進(jìn)胸腺Treg細(xì)胞的發(fā)育是細(xì)胞-細(xì)胞間的接觸所依賴的，而與胸腺B細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子無關(guān);進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析，我們發(fā)現(xiàn)胸腺B細(xì)胞促進(jìn)胸腺Treg細(xì)胞發(fā)育所依賴的細(xì)胞-細(xì)胞間接觸是由胸腺B細(xì)胞表面的M

6、HCⅡ分子和CD40，CD80和CD86這些共刺激分子所介導(dǎo)的。
　　3.胸腺B細(xì)胞促進(jìn)CD4單陽性胸腺細(xì)胞生成Treg前體細(xì)胞
　　在體外胸腺B細(xì)胞和胸腺Treg前體細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)胸腺B細(xì)胞不具備誘導(dǎo)胸腺Treg前體細(xì)胞向成熟Foxp3+Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力;相反，在胸腺B細(xì)胞和胸腺CD4單陽性細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)胸腺B細(xì)胞顯著的促進(jìn)了胸腺CD4單陽性細(xì)胞生成Treg前體細(xì)胞。
　　4.胸腺B

7、細(xì)胞的參與促進(jìn)胸腺Treg細(xì)胞增殖
　　在分析B細(xì)胞敲除的FoxP3-GFP小鼠胸腺中Treg細(xì)胞時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)胸腺B細(xì)胞的缺失導(dǎo)致了處在增殖狀態(tài)的胸腺Treg細(xì)胞比例顯著下降;另外在胸腺Treg細(xì)胞體外增殖的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)胸腺B細(xì)胞的加入能夠顯著的促進(jìn)胸腺Treg細(xì)胞的增殖。
　　5.胸腺B細(xì)胞表面的MHCⅡ分子和CD40/CD80/86分子在促進(jìn)胸腺Treg細(xì)胞增殖中扮演不同的角色
　　在胸腺B細(xì)胞和胸腺Tre

8、g細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中加入表面分子的特異性阻斷抗體，阻斷由這些分子所介導(dǎo)的信號(hào)傳遞，我們發(fā)現(xiàn)胸腺B細(xì)胞所提供的MHCⅡ分子參與到促進(jìn)胸腺Treg細(xì)胞增殖中，但胸腺B細(xì)胞來源的CD40、CD80和CD86這些共刺激分子并不參與其中。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)胸腺B細(xì)胞在胸腺Treg細(xì)胞發(fā)育過程中的作用及其作用機(jī)制，闡明了胸腺B細(xì)胞主要是通過兩種機(jī)制來維持胸腺Treg細(xì)胞的正常數(shù)目，第一個(gè)機(jī)制是促進(jìn)胸腺Treg細(xì)胞的發(fā)育，第二個(gè)機(jī)制是促進(jìn)

9、成熟胸腺Treg細(xì)胞的增殖，這些發(fā)現(xiàn)加深了我們對t-Treg發(fā)育的認(rèn)識(shí)。
　　第二部分NK細(xì)胞在原發(fā)性膽汁性肝硬化致病機(jī)制中作用及機(jī)制的研究
　　原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是由于自身免疫系統(tǒng)攻擊肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞而引起的慢性膽汁淤積性肝臟疾病，該自身免疫疾病的病理學(xué)特征為:肝內(nèi)中小膽管的破壞，匯管區(qū)炎癥細(xì)胞的浸潤。PBC病人肝臟匯管區(qū)浸潤的淋巴細(xì)胞有B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，同時(shí)還包含有N

10、K細(xì)胞。至今我們都在密切關(guān)注適應(yīng)性免疫細(xì)胞在PBC疾病發(fā)生中的作用，并取得了多個(gè)研究成果，卻鮮見針對天然免疫細(xì)胞，特別是NK細(xì)胞在該疾病發(fā)生中作用的研究。肝臟是一個(gè)天然免疫占優(yōu)勢的器官，NK細(xì)胞做為天然免疫細(xì)胞在肝臟中含量很高，人肝臟淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞約占25％-40％，在鼠中也有10％-20％的含量。
　　在我們以前的工作中發(fā)現(xiàn)PBC病人的外周血和肝臟中NK細(xì)胞的比例和數(shù)目均是顯著的增加;并且相對于健康的對照組，來自于病人的NK

11、細(xì)胞體外殺傷能力以及穿孔素的表達(dá)均顯著性增強(qiáng)，但NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力卻顯著下降。雖然以上這些結(jié)果顯示了PBC病人中NK細(xì)胞的表型發(fā)生了顯著性改變，但是NK細(xì)胞在該疾病發(fā)生中的作用以及NK細(xì)胞與其他效應(yīng)細(xì)胞的作用仍然不清楚。在此研究中，我們以dnTGF-βRⅡ模型小鼠做為研究對象，來揭示NK細(xì)胞在PBC樣疾病發(fā)生中的作用及其機(jī)制。已取得的結(jié)果如下:
　　1.在dnTGF-βRⅡ鼠中，肝臟NK細(xì)胞抑制自身免疫性膽管炎
　　

12、對NK細(xì)胞和肝臟炎癥的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，我們發(fā)現(xiàn)在dnTGF-βRⅡ鼠中，肝臟NK細(xì)胞比例與肝臟中單個(gè)核細(xì)胞的數(shù)目呈負(fù)相關(guān)性;進(jìn)一步我們發(fā)現(xiàn)在dnTGF-βRⅡ鼠中敲除NK細(xì)胞顯著的加重了肝臟匯管區(qū)淋巴細(xì)胞的浸潤和肝內(nèi)膽管的破壞。
　　2.肝臟NK細(xì)胞通過抑制肝臟CD4+T細(xì)胞反應(yīng)來抑制肝臟炎癥
　　我們發(fā)現(xiàn)在dnTGF-βRⅡ鼠中敲除NK細(xì)胞顯著的增加了肝臟CD4+T細(xì)胞的數(shù)目;進(jìn)一步我們利用轉(zhuǎn)輸誘導(dǎo)膽管炎模型，將脾臟

13、中的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞共轉(zhuǎn)輸?shù)絉ag1-/-或者NK-/-Rag1-/-小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)NK-/-Rag1-/-小鼠肝臟中顯著增加的是CD4+T細(xì)胞，而不是CD8+T細(xì)胞。
　　3.肝臟DX5-NK細(xì)胞作為CD4+T細(xì)胞的負(fù)性調(diào)節(jié)因子
　　利用體外CD4+T細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)，我們確定肝臟DX5NK細(xì)胞具有抑制CD4+T細(xì)胞增殖的能力，相反肝臟DX5+NK細(xì)胞具有促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖的潛能;同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)肝臟DX