IL-27信號(hào)通路在原發(fā)性膽汁性肝硬化發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是一種慢性炎癥性、進(jìn)行性肝內(nèi)膽汁淤積性自身免疫性病，以血清出現(xiàn)抗線粒體抗體(antimitochondrial antibody,AMA)、肝臟門(mén)脈周?chē)馨图?xì)胞浸潤(rùn)、小膽管特異性破壞為特征，最終發(fā)展成肝硬化和肝衰竭。PBC在任何年齡段均可發(fā)病，主要累及中年婦女，它的發(fā)病高峰出現(xiàn)在50歲左右，25歲以下不常見(jiàn)。PBC典型病理表現(xiàn)為非化膿性損傷，膽管炎或肉芽腫性

2、膽管炎，以破壞小膽管為主，鏡下主要為中間膽管的慢性非化膿性破壞性變化，小葉間膽管減少。目前對(duì)PBC尚沒(méi)有特效的治療方法，熊脫氧膽酸(UDCA)被認(rèn)為是目前治療該病最有效的藥物，雖然可以明顯改善膽汁淤積癥狀，但卻不能阻斷疾病進(jìn)程。PBC發(fā)展到晚期的唯一治療選擇是進(jìn)行肝移植。
　　 PBC的確切發(fā)病機(jī)制至今尚不完全清楚，可能與遺傳因素、病毒和細(xì)菌感染、自身免疫狀態(tài)及環(huán)境因素等有關(guān)。很多研究認(rèn)為本病的發(fā)病機(jī)理是機(jī)體對(duì)自身抗原的耐受性被

3、打破，致使肝內(nèi)中、小膽管上皮細(xì)胞不斷受到免疫系統(tǒng)的攻擊而引起膽汁淤積最終發(fā)病。但是，誘發(fā)自身免疫應(yīng)答的始動(dòng)因素和自身免疫耐受破壞的機(jī)制尚不清楚。研究表明PBC匯管區(qū)浸潤(rùn)的T細(xì)胞中，以CD4+T細(xì)胞居多，因此推斷CD4+T細(xì)胞可能在免疫炎癥中發(fā)揮重要作用。原位雜交分析發(fā)現(xiàn)PBC患者匯管區(qū)IFN-γ的表達(dá)明顯增加，說(shuō)明Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥在導(dǎo)致PBC肝臟病變過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　 IL-27是2002年發(fā)現(xiàn)并命名的一種新的I

4、L-6/IL-12家族細(xì)胞因子，主要作用于固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞而發(fā)揮廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用。IL-27是由兩條多肽鏈EBI3(與IL-12/p40亞基同源)和p28(與IL-12/p35亞基同源)通過(guò)二硫鍵組成的異二聚體。EBI3是一種可溶性細(xì)胞因子受體，最初在EB病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞的培養(yǎng)上清中被發(fā)現(xiàn)。p28則是Pflanz等在基因庫(kù)中找到的一種與IL-6/IL-12家族細(xì)胞因子同源的長(zhǎng)鏈4螺旋多肽，p28不與EBI3結(jié)合時(shí)

5、并無(wú)生物學(xué)活性，IL-27主要由活化的單核細(xì)胞、單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生。IL27的受體是由WSX-1和gp130共同組成。WSX-1和gp130兩者單獨(dú)均不能傳遞IL-27的信號(hào)，它們組成的復(fù)合物是介導(dǎo)IL227的生物學(xué)效應(yīng)的必要受體形式，IL-27受體在T細(xì)胞和NK細(xì)胞的表達(dá)水平最高，其實(shí)是表達(dá)于表達(dá)于單核細(xì)胞，肥大細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞及郎罕氏細(xì)胞等。
　　 IL-27與受體的結(jié)合主要激活JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

6、。IL-27在CD4+和CD8+T細(xì)胞激活JAK1、JAK2、TYK2、STAT1-5。IL-27還可在B細(xì)胞激活STAT1，在單核細(xì)胞激活STAT1和STAT3，以及在肥大細(xì)胞激活STAT3。IL-27在各種細(xì)胞激活不同的JAK/STAT通路而引起的特異的生物學(xué)效應(yīng)。
　　 很多文獻(xiàn)表明，IL-27對(duì)Th1型免疫反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。IL-27可以促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞的增殖，也可以促進(jìn)其向Th1細(xì)胞的分化及產(chǎn)生IFN-γ。

7、而在高度Th1極化的情況下，IL-27的主要作用是限制Th1型免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，從而保護(hù)機(jī)體免受過(guò)度的免疫反應(yīng)的損傷。IL-27在抗感染免疫，抗腫瘤免疫及自身免疫性炎癥等Th1型免疫主導(dǎo)的病理過(guò)程中起重要作用。
　　 基于以上國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀和存在問(wèn)題，本課題擬通過(guò)測(cè)定PBC患者IL-27信號(hào)通路表達(dá)變化，初步了解IL-27信號(hào)通路在PBC發(fā)病機(jī)制中的作用，從而為PBC的免疫學(xué)治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。
　　 第一部

8、分 IL-27介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在原發(fā)性膽汁性肝硬化中的作用
　　 原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是一種膽汁淤積性自身免疫性疾病，以血清中抗線粒體抗體陽(yáng)性(AMA)和肝內(nèi)小膽管進(jìn)行性非化膿性損傷為特征。免疫組化結(jié)果表明PBC患者肝臟匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，這可能與PBC炎癥有著密切的關(guān)系。其病因及發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚。
　　 本部分探討IL-27介導(dǎo)的免疫炎癥性反應(yīng)在PBC發(fā)病機(jī)制中的作用。我們使用熒光定量PCR，流式細(xì)胞術(shù)，

9、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，免疫組化等方法檢測(cè)PBC患者IL-27的表達(dá)，生化常規(guī)測(cè)定PBC患者和健康對(duì)照者的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，堿性磷酸酶(ALP)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，總膽紅素(TBIL)、谷氨?；D(zhuǎn)移酶(GGT)水平，分析IL-27與它們之間的相關(guān)性。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)PBC患者外周血IL-27/P28亞基mRNA的表達(dá)顯著高于CHB和HC組(P＜0.05)，IL-27/EBI3 mRNA未有明顯改變；免疫組化結(jié)果顯

10、示IL-27在PBC患者肝臟呈陽(yáng)性表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明IL-27在PBC患者的CD4+T細(xì)胞表達(dá)率(72.4±6.22％)較慢性乙型肝炎組(59.4±7.03，P＜0.01％)和健康對(duì)照組(1.7±0.55％，P＜0.01)明顯升高，而IL-27在各研究組的CD8+T細(xì)胞，單核細(xì)胞，B細(xì)胞中的表達(dá)無(wú)明顯變化；PBC患者外周血血清IL-27的表達(dá)(126.25±36pg/ml)顯著高于慢性乙型肝炎組(51.81±23.3pg/ml

11、，P＜0.01)和健康對(duì)照組(34.19±9.7pg/ml，P＜0.01)，PBC患者IL-27的血清蛋白表達(dá)水平與GGT(r=0.554，P＜0.01)和TBIL(r=0.559，P＜0.01)水平呈顯著正相關(guān)，與ALT,AST和ALP無(wú)相關(guān)性。
　　 以上結(jié)果說(shuō)明，PBC患者外周血和肝內(nèi)匯管區(qū)均出現(xiàn)IL-27表達(dá)升高，且和一些肝功能指標(biāo)呈正相關(guān)，說(shuō)明可能通過(guò)一些信號(hào)通路促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，最終參與肝內(nèi)匯管區(qū)的

12、炎癥反應(yīng)，使得IL-27在啟動(dòng)PBC發(fā)病早期的炎癥反應(yīng)過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。
　　 第二部分 IL-27對(duì)PBC患者CD4+T細(xì)胞的作用機(jī)制
　　 我們前面的研究表明PBC患者的外周血以及肝臟中IL-27的表達(dá)發(fā)生變化，相關(guān)性分析初步說(shuō)明IL-27的表達(dá)變化與PBC患者的肝功能呈正相關(guān)，但是IL-27是如何發(fā)揮作用的?作用在什么細(xì)胞上的?基于這些疑問(wèn)，我們?cè)诒静糠值难芯糠蛛xPBC患者的CD4+T細(xì)胞，觀察IL-27對(duì)P

13、BC患者CD4+T細(xì)胞的分化、增值以及細(xì)胞因子分泌的影響，闡述IL-27通過(guò)CD4+T細(xì)胞在PBC發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 結(jié)果表明，IL-27可以誘導(dǎo)各研究組STAT1和STAT3酪氨酸磷酸化的表達(dá)，PBC患者組中最明顯；IL-27還可以增強(qiáng)PBC患者組CD4+T細(xì)胞中T-bet的表達(dá)，抑制GATA3的表達(dá)；對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)，IL-27可以增加PBC患者中CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2，γ-IFN的表達(dá)，抑制IL-10

14、的表達(dá)。
　　 本部分研究說(shuō)明IL-27可以促進(jìn)PBC患者中CD4+T細(xì)胞向Th1分化，同時(shí)γ-IFN的表達(dá)增加更容易誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的活化，使機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)發(fā)生過(guò)度，導(dǎo)致了機(jī)體內(nèi)免疫平衡的紊亂和免疫耐受的破壞，從而誘發(fā)了自身免疫性疾病。
　　 第三部分 IL-27作用于PBC患者的單核細(xì)胞
　　 前面的研究表明PBC患者的外周血以及肝臟中IL-27的表達(dá)發(fā)生變化，且IL-27作用PBC患者CD4+T細(xì)胞后影響Th

15、1的分化改變，在本部分的研究中，我們觀察IL-27對(duì)PBC患者單核細(xì)胞的作用，進(jìn)一步的闡述IL-27在PBC發(fā)病機(jī)制中的作用。結(jié)果表明，IL-27可以誘導(dǎo)各研究組STAT1和STAT3酪氨酸磷酸化的表達(dá)，PBC患者中最明顯；相對(duì)于正常組，IL27能明顯增加PBC患者單核細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1(P＜0.01)和TNF-α(P＜0.01)，而沒(méi)有增加IL-8的表達(dá)(P＞0.05)。
　　 綜上所述，IL-27可以影響單核細(xì)胞培養(yǎng)上清